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Sep 14, 2023

Inactivateur DSF RpfB homologue FadD régulé positivement dans Bradyrhizobium japonicum dans des conditions de limitation du fer

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8701 (2023) Citer cet article

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Bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) provoque la pourriture noire et d'autres maladies des plantes. Xcc détecte le facteur de signal diffusible (DSF) comme un signal de détection de quorum (QS) qui médie principalement l'absorption de fer et la virulence. RpfB désactive DSF dans ce circuit DSF-QS. Nous avons examiné les profils différentiels d'expression génique de Bradyrhizobium japonicum dans des conditions de fer faibles ou élevées et avons constaté que fadD et irr étaient régulés positivement dans des conditions de fer faible (changement log2 de 0,825 et 1,716, respectivement). En plus d'avoir des modèles de repliement de protéines similaires et des similitudes de domaine fonctionnel, FadD partageait une similitude de séquence de 58 % avec RpfB de Xcc. Les complexes RpfB – DSF et FadD – DSF avaient des scores d'amarrage moléculaire SWISSDock de − 8, 88 kcal / mol et − 9, 85 kcal / mol, respectivement, et les résultats de simulation de dynamique moléculaire à 100 ns étaient en accord avec les résultats d'amarrage. Cependant, des différences significatives ont été trouvées entre les énergies de liaison de FadD – DSF et de RpfB – DSF, indiquant un éventuel renouvellement de DSF dépendant de FadD. Le réseau d'interaction protéine-protéine a montré que FadD se connectait indirectement à la perméase du transporteur ABC (ABCtp), qui était également régulée positivement (changement log2 de 5,485). Nous supposons que la condition de faible teneur en fer peut être un stimulus environnemental mimétique pour la régulation à la hausse de fadD chez B. japonicum afin de désactiver le DSF, d'inhiber l'absorption de fer et la virulence des voisins producteurs de DSF. Cette découverte offre une nouvelle option d'utilisation de B. japonicum ou d'un B. japonicum génétiquement amélioré comme agent potentiel de lutte biologique contre Xcc, avec l'avantage supplémentaire de propriétés favorisant la croissance des plantes.

Le fer est l'élément le plus omniprésent dans la croûte terrestre après l'oxygène, le silicium et l'aluminium. Le fer existe généralement à l'état d'oxydation ferreux (Fe2+) ou ferrique (Fe3+)1. Le fer ferrique a une solubilité relativement faible, bien qu'il soit la forme prédominante dans l'environnement oxygéné de la Terre, ce qui pose un défi aux bactéries à métabolisme aérobie. À faible pH, le fer ferreux le plus soluble est le plus abondant dans un environnement anaérobie ou microaérobie2. Le fer est essentiel à l'activité des enzymes régulatrices et métaboliques, c'est pourquoi il est essentiel à la physiologie bactérienne. Cependant, le fer peut être toxique pour les cellules en raison de son potentiel de transport d'électrons à un pH physiologique. Les bactéries ont développé des mécanismes pour collecter activement le fer de l'environnement lorsque le fer est rare et pour contrôler la disponibilité du fer libre intracellulaire lorsque le fer est abondant3. Cette homéostasie du fer est cruciale à la fois pour la virulence et pour les processus cellulaires normaux1. Le régulateur d'absorption ferrique (Fur) est un régulateur transcriptionnel global de l'homéostasie du fer, de la virulence et du stress oxydatif4. La fourrure a fait l'objet de nombreuses recherches sur Escherichia coli5 et il a été démontré qu'elle régule l'expression dépendante du fer de plus de 90 gènes6. La fourrure fonctionne comme un répresseur positif car lorsqu'elle interagit avec le fer (son co-répresseur), elle supprime la transcription et lorsque le fer est absent, elle déprime la transcription6. La fourrure est une protéine de liaison à l'ADN homodimère qui lie un ion ferreux par sous-unité. À de faibles concentrations de fer, l'affinité de liaison à l'ADN de l'apo-Fur (fourrure sans fer) est environ 1000 fois inférieure à celle de la fourrure et son activité est réduite, ce qui entraîne une absorption du fer, une suppression du petit ARN RyhB, une diminution du stockage du fer et une diminution synthèse fer-protéine6. Les sidérophores sont des molécules extracellulaires de chélation du fer ferrique qui sont synthétisées par les bactéries pour l'acquisition du fer7. Les souches bactériennes incapables de produire des sidérophores utilisent souvent des sidérophores produits par d'autres souches bactériennes, ce qui leur confère un avantage concurrentiel dans la compétition inter-espèces ou dans des conditions limitant le fer8. Les bactéries ont d'autres mécanismes d'acquisition du fer, notamment l'absorption de l'hème et un système de transport du fer ferreux2,9. Cependant, il a été constaté que les souches mutantes de la fourrure manquaient d'homéostasie appropriée du fer, et une concentration élevée de fer intracellulaire a été détectée en raison d'une production constamment élevée de sidérophores4. Chez les plantes hôtes, les souches mutantes de la fourrure avaient une résistance au stress oxydatif diminuée et des traits de virulence diminués4,10. Ces résultats mettent en évidence l'importance du fer et de la fourrure dans la pathogénicité des bactéries phytopathogènes.

Les rhizobactéries sont des α-protéobactéries du sol qui peuvent établir des relations symbiotiques avec des plantes légumineuses (par exemple, le soja)11. Dans une relation symbiotique, les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes favorisent le développement des plantes par le biais de divers mécanismes, y compris, mais sans s'y limiter, la fixation de l'azote, la solubilisation du phosphate, la production de phytohormones, la production d'antibiotiques et l'interférence de la détection du quorum (QS)12. La plupart des bactéries utilisent le QS comme mécanisme de communication dépendant de la densité cellulaire13. Le QS est médié principalement par la N-acyl homosérine lactone, et la vie sociale des bactéries est en partie dictée par le QS. Chez les bactéries phytopathogènes telles que Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), le QS est médié par des membres de la famille du facteur de signal diffusible (DSF), tels que le DSF, l'acide cis-2-dodécénoïque (BDSF), l'acide cis,cis-11-méthyldodéca-2,5-diénoïque (IDSF ), l'acide trans-2-décénoïque (SDSF) et le facteur favorisant la réanimation RpfB régule le renouvellement du DSF14. Les séquences de ligase CoA d'acides gras à longue chaîne (FadD) d'Escherichia coli, de Sinorhizobium meliloti et d'Agrobacterium tumefaciens sont homologues à la séquence RpfB de Xcc15. La perturbation des signaux QS par conversion enzymatique de l'homosérine lactone ou DSF est appelée extinction du quorum, et QQ améliore souvent l'aptitude compétitive des espèces bactériennes16. Bradyrhizobium japonicum est une rhizobactérie qui favorise la croissance des plantes12. Dans la souche LO de B. japonicum, l'homéostasie du fer et les gènes régulés par le fer sont régulés par la protéine régulatrice de la réponse du fer (Irr) et ne se limitent pas à la biosynthèse de l'hème5. Dans ce travail, nous avons analysé les niveaux d'expression génique différentiels dans la souche LO de B. japonicum dans des conditions de fer faibles et élevées, à l'aide de profils d'expression de micropuces de l'ensemble de données NCBI Gene Expression Omnibus (GEO : GSE4143) et d'interactions protéine-protéine à l'aide de STRING. Nous avons constaté que l'expression du gène fadD de B. japonicum était régulée à la hausse dans des conditions de faible teneur en fer (log2 fold change (FC) 0,825). Nous avons également constaté que les séquences d'acides aminés de B. japonicum FadD et Xcc RpfB partageaient 58% d'identité et que l'énergie de liaison de FadD – DSF était significativement supérieure à celle de RpfB – DSF, indiquant un renouvellement potentiel de DSF dépendant de FadD. Nous supposons que la condition de faible teneur en fer peut être un stimulus environnemental mimétique pour B. japonicum qui régule à la hausse fadD pour désactiver le DSF, inhiber l'absorption du fer et la virulence des voisins producteurs de DSF.

L'analyse de l'ensemble de données GEO GSE4143 a montré que 642 gènes étaient exprimés de manière significativement différentielle (DEG) dans des conditions de faible teneur en fer (fer faible ou élevé) (Fig. 1). Seuls 457 des 642 DEG ont été utilisés pour des analyses supplémentaires (tableau supplémentaire S1). Parmi les 642 DEG, 384 étaient régulés positivement et 258 étaient régulés négativement (Fig. 2a). Les gènes fadD et irr de B. japonicum ont été régulés positivement (log2 FC 0,825 et 1,716, respectivement) (Fig. 2b). Notamment, le gène de la perméase du transporteur ABC (ABCtp, blr3355) était également régulé positivement (log2 FC 5,485).

Gènes différentiellement exprimés entre Bradyrhizobium japonicum cultivés dans des conditions de fer faibles et élevées. (a) Parcelle volcanique. ( b ) Graphique de différence moyenne montrant le changement de pli log2 (axe x) par rapport aux valeurs d'expression log2 moyennes (axe y). Les gènes ont été considérés comme exprimés de manière significativement différentielle lorsque la valeur p ajustée au taux de fausses découvertes de Benjamini – Hochberg était <0, 05. ( c ) Diagramme de Venn du chevauchement des gènes exprimés de manière significativement différentielle entre les conditions de fer faible et élevé. L'ensemble de données Gene Expression Omnibus GSE4143 a été utilisé dans cette analyse. Des tracés graphiques ont été générés à l'aide de l'outil d'analyse GEO2R et adaptés pour une meilleure lisibilité.

Gènes différentiellement exprimés (DEG) et voies métaboliques KEGG enrichies. ( a ) Diagramme de contingence des 642 DEG entre les conditions de fer faible et élevée. ( b ) Niveaux d'expression différentiels de irr et fadD dans des conditions à faible teneur en fer par rapport à des conditions à teneur élevée en fer. ( c ) Voies métaboliques KEGG des DEG sans filtre de coupure. La voie de détection du quorum avait un taux d'enrichissement très faible de 0,01 avec un gène d'entrée (fadD) et 19 gènes de fond. Les voies KEGG ont été divisées en huit groupes principaux (C1 à C8) en fonction de leurs fonctions.

L'analyse de l'enrichissement des voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) avec le Benjamini-Hochberg FDR (P <0,05) des DEG a montré que la plupart des gènes sous-régulés étaient impliqués dans l'assemblage flagellaire, le ribosome, la phosphorylation oxydative, les voies métaboliques, la fixation du carbone dans les organismes photosynthétiques, métabolisme de la porphyrine et de la chlorophylle, métabolisme du carbone, métabolisme microbien dans divers environnements, métabolisme du glyoxylate, du dicarboxylate et biosynthèse des métabolites secondaires (tableau supplémentaire S2), alors que la plupart des gènes régulés positivement étaient impliqués dans le relais du soufre (moaE, moaD, mnmA) et les voies de résistance aux bêta-lactamines (acrB, ampC, acrA) (tableau supplémentaire S3). De plus, nous avons utilisé le système d'annotation basé sur l'orthologie KEGG (KOBAS) également sans le réglage du filtre Benjamini – Hochberg FDR (p <0, 05) et identifié une voie QS qui avait un gène (fadD) et 19 gènes de fond (Fig. 2c).

Nous avons construit un grand réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) des DEG (Fig. S1 supplémentaire) et avons constaté que les protéines codées dans les 50 nœuds principaux étaient impliquées dans deux voies KEGG importantes, à savoir les voies d'assemblage des ribosomes et des flagelles. La protéine rpmC dans la voie du ribosome et le nœud 2734684 dans les voies d'assemblage des flagelles relient ces deux voies métaboliques (Fig. 3a). Notamment, les 15 principaux nœuds de goulot d'étranglement comprenaient la protéine Irr, alors que FadD ne figurait pas parmi les 50 principaux nœuds hub ou 15 nœuds de goulot d'étranglement (Fig. 3b). Le réseau PPI est composé de sous-réseaux, notamment FadD, assemblage flagellaire, ribosome et grappes de nodulation racinaire (Fig. S1 supplémentaire). FadD interagit avec des nœuds spécifiques, à savoir 27354240, 27354241, 27354239, 27354242, 27352300, 27349302, 27351614, 27351617, 27348347 (Fig. 3c). Une analyse distincte basée sur STRING17 du cluster FadD PPI a identifié des voies de transport QS et ABC significatives avec des valeurs p ajustées au FDR de 7, 64e-09 et 2,82e-05, respectivement (tableau 1). De plus, FadD et 27354240 ont participé exclusivement à la voie QS, tandis que 27354239, 27354241, 27354242, 27352300, 27349302 et 27351614 ont participé aux voies de transport QS et ABC. De plus, les nœuds 27351614 et 27348347 ont participé à diverses voies, y compris l'homéostasie cellulaire du fer (Fig. 3c). Les résultats ont également montré que FadD était indirectement lié à ABCtp, qui était régulé positivement (log2 FC 5,485) (Fig. 3d).

Réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) des gènes exprimés de manière différentielle et des nœuds hub et goulot d'étranglement. (a) Top 50 des nœuds hub du réseau PPI. Les nœuds concentrateurs de connexion sont dans des cases bleues. (b) Les 15 principaux nœuds de goulot d'étranglement du réseau PPI. La protéine Irr est en bas à droite. ( c ) Le cluster FadD du réseau PPI a été séparé et étudié à l'aide de STRING. Les nœuds sont de plusieurs couleurs selon les voies impliquées : rouge, détection de quorum (bja02024)58,59,60 ; bleu, transporteurs ABC (bja02010)58,59,60 ; mixte, y compris la ferrédoxine NADP réductase et les bactéries; et jaune, homéostasie des ions fer cellulaires (cluster de réseau local (STRING), CL : 1531). ( d ) Niveaux d'expression différentiels des gènes de nœuds impliqués dans diverses voies, y compris la détection de quorum et les voies de transport ABC.

L'alignement des séquences d'acides aminés de B. japonicum FadD et Xcc RpfB a montré qu'elles partageaient 58% de similitude (Fig. S2 supplémentaire) et avaient des domaines de famille de protéines identiques dans des positions très similaires dans leurs séquences (tableau supplémentaire S4). Un alignement de séquences multiples et un arbre phylogénétique ont montré que B. japonicum FadD ressemblait de manière significative à d'autres séquences d'acides aminés FadD bactériennes déjà connues pour être homologues à la séquence Xcc RpfB (Fig. 4). L'évaluation structurelle des structures protéiques prédites par AlphaFold18 de RpfB (AF-Q8P9K5-F1) et FadD (AF-A0A0A3XRM6-F1) à l'aide de l'outil RRDistMaps dans l'UCSF Chimera19 a détecté des similitudes dans leurs structures tridimensionnelles (Fig. S2 supplémentaire) et Xcc RpfB et B. japonicum FadD avaient des scores TM-align20 de 0,95995 et 0,95828 respectivement, confirmant que les structures étaient très similaires.

Comparaison des séquences d'acides aminés FadD de Bradyrhizobium japonicum, espèces bactériennes apparentées et RpfB de Xcc. (a) Alignement de séquences multiples et (b) arbre phylogénétique. Les valeurs bootstrap sont affichées à côté des branches.

Les scores d'amarrage moléculaire de RpfB – DSF et FadD – DSF utilisant CB-Dock221 et AutoDock Vina22 n'étaient pas très différents (Fig. 5), alors que les scores SWISSDock23 et fastDRH24 différaient significativement. Plus précisément, RpfB–DSF avait un score SWISSDock de − 8,88 kcal/mol et les scores fastDRH MM-PBSA et MM-GBSA de − 22,27 et − 34,07 kcal/mol respectivement, tandis que FadD–DSF avait un score SWISSDock de − 9,85 kcal/mol et les scores fastDRH MM-PBSA et MM-GBSA de - 34, 02 kcal / mol et - 38, 07 kcal / mol respectivement (tableau 2). Les résidus de contact entre RpfB et DSF étaient PRO84, ASN85, PRO108, LEU109, ILE130, ASN132, PHE133, LEU154, LEU176, THR259, ALA260, LEU261, PRO262, LEU263, TYR264, ILE286, SER287, ASN288, PRO289, et ARG290, alors que les résidus de contact entre FadD et DSF étaient ASN236, TRP239, LEU240, PHE265, ALA269, LEU273, ILE331, ASN333, GLY334, GLY335, GLY336, MET337, GLfY358, TYR359, GLY360, LEU361, PRO366, THR367, THR369 et CYS370 (supplémentaire figure S3). De plus, les 10 principaux résidus de points chauds potentiels et les 30 principaux résidus de carte thermique ont été identifiés (Fig. S4 supplémentaire) sur la base d'une analyse de décomposition d'énergie par résidu de plusieurs poses d'amarrage du ligand24. Par conséquent, ils (Fig. S4 supplémentaire) sont peut-être très utiles pour les futurs efforts de conception de médicaments contre RpfB Xcc.

Interactions biophysiques entre les récepteurs RpfB et FadD et le ligand DSF par simulations d'amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire (MD). ( a, b ) Amarrage moléculaire entre DSF et RpfB de Xcc ( a ), et entre DSF et FadD de Bradyrhizobium japonicum ( b ). DSF est indiqué par les structures boule et bâton rouges. ( c, d ) RMSD des récepteurs et des ligands dans les complexes. (e, f) RMSF des récepteurs et des ligands dans les complexes. ( g ) Rayon de giration (Rg) des protéines réceptrices. ( h ) Nombre de liaisons H et résidus d'acides aminés impliqués dans la liaison H calculés à l'aide des complexes récepteur-ligand générés lors des simulations de dynamique moléculaire de 100 ns. Le seuil est représenté par une ligne pointillée.

Pour confirmer les résultats de l'amarrage moléculaire, l'énergie libre de liaison a été estimée sur la base de modèles de solvatation implicites pour les protéines FadD et RpfB complexées avec DSF. Les calculs MM-PBSA / GBSA utilisant des trajectoires MD de 100 ns ont montré que l'affinité de liaison pour FadD – DSF était bien supérieure à celle de RpfB – DSF (tableau 2), ce qui a confirmé les résultats de l'amarrage moléculaire. Les forces de van der Waals étaient les principaux contributeurs à l'affinité protéine-ligand en raison de la nature lipophile de la molécule de ligand.

Pour explorer les mouvements des deux complexes au cours des simulations, les valeurs d'écart quadratique moyen (RMSD) et de fluctuation (RMSF), ainsi que le rayon de giration (Rg) ont été tracés en fonction du temps (Fig. 5c – g). Les valeurs de FadD – DSF RMSD étaient plus élevées (RMSD = 3, 64 Å) que celles de RpfB – DSF (RMSD = 2, 78 Å), indiquant que FadD déviait plus que RpfB de l'état initial (Fig. 5c). La RMSD du ligand dans le complexe FadD – DSF est restée inchangée au seuil de 1, 0 Å, tandis que la RMSD du ligand dans le complexe RpfB – DSF a considérablement changé, probablement parce que le DSF a été libéré du site de liaison (Fig. 5d). Les valeurs RMSF du récepteur ont identifié des résidus d'acides aminés associés à la grande flexibilité des régions N- et C-terminales de RpfB (Fig. 5e). Les valeurs RMSF de DSF ont montré des modèles de flexibilité similaires à ceux des valeurs RMSF pour les récepteurs ; c'est-à-dire que DSF était plus flexible dans le complexe RpfB – DSF que dans le complexe FadD – DSF (Fig. 5f). Les valeurs de Rg ont montré que RpfB était plus compact que FadD dans les complexes ; c'est-à-dire que les valeurs de Rg étaient plus élevées pour FadD que pour RpfB (Fig. 5g).

Le nombre de liaisons H entre les récepteurs et leurs ligands a été évalué pour déterminer la contribution des liaisons H à l'affinité de liaison. L'affinité de liaison était élevée entre FadD et DSF bien que seuls deux acides aminés (Gly336 et Gly360) aient été impliqués dans la formation de liaisons H. Cependant, neuf résidus d'acides aminés étaient impliqués dans la formation de liaisons H entre RpfB et DSF, l'affinité de liaison était probablement faible parce que le ligand était libéré du site de liaison (Fig. 5h).

Les bactéries sont généralement entourées de diverses souches et espèces qui se disputent les ressources vitales limitées25. Par conséquent, les bactéries ont développé des stratégies pour décimer et déloger leurs voisins, y compris, mais sans s'y limiter, les sécrétions pour recueillir des ressources (par exemple, les sidérophores pour le fer), blesser ou empoisonner les cellules voisines26 et établir des microcolonies tout en empêchant d'autres organismes de le faire27. Les biofilms sont des microcolonies agrégées de cellules microbiennes associées à la surface entourées d'une substance polymère extracellulaire (EPS) et régies principalement par QS28. Le QS joue également un rôle crucial dans la régulation de la virulence et de la formation de biofilm chez Xcc29. Inversement, les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes telles que B. japonicum peuvent favoriser la croissance des plantes par interférence QS ou extinction du quorum des bactéries phytopathogènes adjacentes10,12. Récemment, l'accent a été mis sur les signaux QS, y compris les signaux de la famille DSF30, et le QS s'est avéré être associé à des avantages ou à des interactions compétitives26. Le DSF et le BDSF sont des médiateurs du processus QS dans Xcc14, et le RpfB peut désactiver le DSF par β-oxydation via son activité acyl-CoA ligase grasse31. De plus, le DSF peut potentiellement nuire au développement, à la croissance et à l'immunité des plantes hôtes31. Dans Xcc, des concentrations extracellulaires élevées de DSF activent le système RpfC – RpfG à des densités cellulaires élevées, soulageant l'inhibition de c-di-GMP sur le facteur de transcription global Clp qui régule l'expression de plusieurs facteurs de virulence et l'absorption du fer32. Xcc rpfF a produit le mutant homologue DSF et rpfF Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) qui étaient déficientes en croissance et en production de DSF33. Xoo est une bactérie phytopathogène qui provoque la brûlure bactérienne des plants de riz. Les souches mutantes homologues de Xoo rpfF ont montré une sensibilité inhabituelle à la tétracycline dans des conditions de faible teneur en fer et une résistance à la tétracycline lors d'une supplémentation en fer33. La pathogénicité dépendante du fer de Xoo dans les plants de riz a été rapportée34. Xcc, peut produire de la xanthoferrine, un sidérophore nécessaire pour une virulence et une croissance maximales dans des conditions de faible teneur en fer35. La xanthoferrine peut se lier au fer ferrique et favoriser la croissance de Xcc dans les plantes hôtes35. Ces résultats montrent l'importance du fer et du système QS dépendant du DSF pour la manifestation des traits de virulence des bactéries phytopathogènes.

Les séquences FadD de E. coli, S. meliloti et A. tumefaciens sont des homologues de la séquence Xcc RpfB15. Cependant, aucune homologie entre B. japonicum FadD et Xcc RpfB n'a été signalée auparavant. L'alignement des séquences d'acides aminés de B. japonicum FadD et Xcc RpfB a montré qu'elles partageaient 58% de similitude (Fig. S2 supplémentaire). La similarité de séquence offre un aperçu des fonctions des protéines36. Les scores TM-align des structures tridimensionnelles de deux protéines modèles peuvent être obtenus en comparant leurs équivalences de résidus20. Xcc RpfB et B. japonicum FadD avaient des scores d'alignement TM de 0,95995 et 0,95828 respectivement, ce qui indique des modèles de repliement de protéines similaires. Ainsi, en plus de partager la similarité des séquences, ils ont partagé des modèles de repliement des protéines et des domaines de la famille des protéines (tableau supplémentaire S4), indiquant des similitudes fonctionnelles potentielles entre les deux protéines. De plus, la RMSD de RpfB dans le RpfB-DSF était inférieure à la RMSD de FadD dans FadD-DSF tout au long des trajectoires MD. RMSD mesure la différence entre les structures initiale et finale d'une protéine. Des divergences au cours de la trajectoire MD d'une structure protéique peuvent indiquer sa stabilité conformationnelle37. Pour FadD, les fluctuations RMSD ne dépassaient pas environ 4–6 Å (environ 40–100 ns), indiquant une petite plage de fluctuation. Pour le ligand dans les deux complexes, les fluctuations de RMSD ont montré des tendances opposées. Les fluctuations de RMSD pour le DSF étaient plus élevées dans le complexe RpfB – DSF qu'elles ne l'étaient dans le FadD – DSF tout au long des trajectoires MD (Fig. 5). De petites fluctuations de RMSD indiquent une liaison de ligand stable38. RMSF quantifie les déplacements moyens des résidus d'acides aminés à partir d'un point de référence sur une trajectoire MD, et par conséquent RMSF peut identifier les régions structurelles qui s'écartent le plus de leur structure initiale39. Notamment, certaines régions protéiques de RpfB-DSF et FadD-DSF, environ 150-160 et 455 à l'extrémité C-terminale, présentaient des fluctuations similaires et, en moyenne, les RMSF de RpfB-DSF et FadD-DSF étaient globalement similaires, indiquant interactions récepteur-ligand satisfaisantes. Le Rg indique la distribution des atomes autour de l'axe d'une protéine, et est une mesure de la distance entre le point où elle tourne et le point où le transfert d'énergie a le plus grand impact possible40. Pour RpfB dans RpfB-DSF, le Rg est resté entre 23,5 Å et 24,5 Å. Pour FadD dans FadD–DSF, le Rg a commencé à fluctuer après 40 ns puis est resté proche de 25 Å jusqu'à 100 ns. Les plus de 500 liaisons H qui ont été prédites pour former par GLY336 de FadD – DSF indiquent la dominance unique de GLY336 dans les interactions récepteur-ligand, alors que de nombreux résidus d'acides aminés ont été prédits pour former des liaisons H dans RpfB – DSF . Parce que les liaisons H aident à créer et à stabiliser les structures protéiques, la formation de liaisons H tout au long de la trajectoire MD suggère des interactions récepteur-ligand stables dans RpfB-DSF et FadD-DSF.

Des différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression génique entre deux conditions expérimentales sont utilisées pour identifier les DEG42. Nous avons identifié 642 DEG chez B. japonicum en comparant les niveaux d'expression génique dans des conditions de fer faibles et élevées (Fig. 1). La protéine Irr et FadD sont importantes pour l'homéostasie du fer et le QS ou l'extinction du quorum. Nous avons constaté que fadD et irr de B. japonicum étaient régulés positivement dans des conditions de faible teneur en fer (log2 FC 0,825 et 1,716, respectivement). De plus, le rapport a indiqué que la protéine Irr était nécessaire pour un sens adéquat du statut en fer cellulaire5. De plus, l'absence d'une réponse normale au fer et de gènes associés au fer dans une souche mutante irr s'est avérée diminuer la teneur totale en fer cellulaire5. Ces caractéristiques de la protéine Irr expliquent la régulation à la hausse de irr dans des conditions de faible teneur en fer. Cependant, l'importance de la régulation à la hausse de fadD chez B. japonicum dans des conditions de faible teneur en fer n'a pas été expliquée dans des études antérieures.

Dans la présente étude, l'analyse de l'enrichissement fonctionnel de la liste des gènes a identifié les voies d'assemblage des flagelles et des ribosomes comme les deux principales voies avec des valeurs de p ajustées au FDR <0,05 (tableau supplémentaire S2), et les gènes associés à ces deux voies métaboliques figuraient parmi les 50 premiers. nœuds concentrateurs dans le réseau PPI (Fig. 3a). De plus, les nœuds hub qui relient ces deux voies, rpmC du réseau ribosomique et 27348641 du réseau d'assemblage flagellaire, se sont avérés d'une importance critique (Fig. 3a). Cependant, seule la protéine Irr figurait parmi les 15 principaux nœuds de goulot d'étranglement de l'ensemble du réseau PPI (Fig. 3b), bien que FadD ne figurait pas parmi les 50 principaux nœuds de goulot d'étranglement / hub. Notamment, le niveau d'expression de fadD (log2 FC 0,825) était presque la moitié de celui de la protéine Irr (log2 FC 1,716). Cette découverte soulève la question de savoir pourquoi une expression élevée de fadD se produit chez B. japonicum lorsque la disponibilité du fer était restreinte.

Chez les bactéries, le fer joue un rôle physiologique crucial dans la réplication, la transcription, le métabolisme, la production d'énergie par la respiration et la pathogénicité de l'ADN3. Des conditions de faible teneur en fer peuvent déclencher des processus qui empêchent l'absorption du fer par d'autres micro-organismes, assurant ainsi des conditions optimales pour la survie de soi. Le facteur de transcription de liaison au fer ferrique XibR, qui contrôle de manière coordonnée l'expression de gènes liés au métabolisme du fer, à la chimiotaxie et à la motilité flagellaire, s'est avéré nécessaire pour une virulence optimale de Xcc43. Dans des conditions de faible teneur en fer, les souches mutantes XibR ont montré une croissance réduite et une diminution des concentrations intracellulaires de fer43. L'importance du métabolisme du fer dans la physiopathologie des bactéries est en outre étayée par la découverte que le puissant bactéricide Xinjunan (dioctyldiéthylènetriamine) a agi en modifiant le métabolisme cellulaire du fer44.

En plus de fadD, il a été démontré que d'autres gènes tels que fadE et fadR jouent des rôles critiques dans la β-oxydation chez E. coli45. Fait intéressant, fadE, fadF, fadG, fadH, fadL et le régulateur transcriptionnel fadR se sont également avérés être impliqués dans le métabolisme des lipides bactériens, mais aucun de ces gènes n'a été exprimé de manière différentielle chez B. japonicum par rapport à des conditions de fer faibles ou élevées (tableau supplémentaire S1). Dans des conditions de ressources limitées, les bactéries optent généralement pour des voies économes en énergie et la transcription non essentielle est généralement empêchée par des opérons tels que l'opéron lactose dans E. coli47. Nous avons constaté que fadD était régulé à la hausse chez B. japonicum dans des conditions de faible teneur en fer (Fig. 3c), ce qui implique que l'expression élevée de fadD peut être attribuable à d'autres facteurs. L'analyse basée sur STRING du cluster FadD dans le réseau PPI (Fig. S1 supplémentaire) a trouvé deux voies KEGG cruciales: les voies de transport QS et ABC (tableau 1). Cependant, les prédictions de voies basées sur STRING et KEGG ont des limites car ces méthodes ne sont pas optimisées ou adaptées aux interactions multi-espèces. En effet, une communauté bactérienne homogène ou isogénique est rare car un large éventail de micro-organismes sont des habitants typiques des bactéries48. De plus, les bactéries peuvent blesser et surpasser leurs voisines lorsque les ressources sont rares via leur signalisation cellulaire ou leurs voies métaboliques27. Parmi les autres DEG, ABCtp (blr3355) était régulé positivement (log2 FC 5,485) et était indirectement connecté à FadD (Fig. 3d). Les perméases sont des protéines de transport membranaire36 capables de transporter des protéines hors des cellules. La forte expression de ABCtp (blr3355) dans des conditions de faible teneur en fer indique qu'il était nécessaire et probablement lié au transport extracellulaire de FadD. De plus, le transporteur ABC s'est avéré être régulé positivement chez Streptococcus pneumoniae par deux mécanismes QS différents49.

Le QS joue un rôle important dans la rivalité inter-espèces50 et la coopération51, et une inhibition du QS entre les espèces a été rapportée52. RpfB désactive le DSF dans Xcc14, ce qui peut perturber le circuit de signalisation cyclique médié par di-GMP et Clp de l'absorption cellulaire du fer31,32,53,54,55,56 similaire à Xanthomonas campestris (Fig. 6a). De plus, B. japonicum FadD et Xcc RpfB sont homologues (Fig. 4) et une différence significative dans les énergies de liaison de FadD – DSF et RpfB – DSF a été détectée (tableau supplémentaire S3), ce qui indique un chiffre d'affaires potentiel de DSF dépendant de FadD (Fig. 6b). Par conséquent, nous supposons que la condition de faible teneur en fer peut être un stimulus environnemental mimétique pour la régulation à la hausse de fadD chez B. japonicum afin de désactiver le DSF et d'inhiber l'absorption de fer et la virulence des voisins producteurs de DSF. Cela peut expliquer pourquoi fadD et ABCtp ont été régulés positivement chez B. japonicum dans des conditions de faible teneur en fer.

Cascade de signalisation moléculaire proposée des réponses cellulaires médiées par le DSF. ( a ) Détection de quorum médiée par DSF chez Xanthomonas campestris, obtenue auprès de KEGG (bja02024) 58, 59, 60 ( b ) Mode d'action possible de la communication inter-espèces via DSF de Xcc et l'homologue RpfB FadD de Bradyrhizobium japonicum.

Nous avons analysé l'expression différentielle des gènes de B. japonicum dans des conditions de fer faibles et élevées et avons constaté que les gènes FadD, Irr et ABCtp étaient régulés positivement (log2 FC 0,852, 1,724 et 5,485, respectivement). Le réseau PPI a indiqué que FadD était indirectement lié à ABCtp. Nous avons identifié des modèles de repliement de protéines similaires, des domaines fonctionnels et une similitude de séquence de 58 % entre FadD de B. japonicum et RpfB de Xcc. Nous avons également identifié les voies de transport QS et ABC par une analyse basée sur STRING des DEG. L'amarrage moléculaire a montré une différence significative dans les énergies de liaison entre FadD – DSF et RpfB – DSF, indiquant un chiffre d'affaires potentiel de DSF dépendant de FadD qui était soutenu par les simulations MD. Nous supposons que des conditions de faible teneur en fer peuvent être un stimulus environnemental mimétique pour la régulation à la hausse de fadD chez B. japonicum afin de désactiver l'absorption de fer médiée par le DSF et la virulence des voisins producteurs de DSF. Nos résultats offrent une nouvelle option d'utilisation de B. japonicum ou de B. japonicum génétiquement modifié comme agent de lutte biologique contre les maladies des plantes causées par Xcc. Cependant, pour aider à assurer la production agricole face au changement climatique, la recherche exploratoire sur l'édition de gènes FadD pourrait constituer un axe important pour les études futures.

Une recherche documentaire a été effectuée avec des combinaisons de mots-clés tels que rhizobactéries favorisant la croissance des plantes, PGPR, Bradyrhizobium japonicum, détection de quorum, fer et nodulation à l'aide de Google Scholar (https://scholar.google.com/) et PubMed (https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Nous avons également recherché les ensembles de données de puces à ADN dans le NCBI Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) et sélectionné l'ensemble de données GSE4143 pour analyse (tableau 3). Les échantillons GEO GSM94778, GSM94780 et GSM94781 ont été cultivés dans des conditions à faible teneur en fer, et les échantillons GEO GSM94783, GSM94784 et GSM94785 ont été cultivés dans des conditions à teneur élevée en fer. En bref, la souche B. japonicum LO a été cultivée dans un milieu GSY modifié sans source de fer exogène pour donner une concentration de fer de 0,3 µM dans le milieu (condition à faible teneur en fer) et dans un milieu GSY modifié additionné de 12 µM de FeCl3.6H2O (riche en fer état)5.

Des gènes différentiellement exprimés (DEG) entre B. japonicum cultivés dans des conditions de fer faibles et élevées ont été identifiés à l'aide de GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)57. Les gènes dans les critères de coupure de la valeur P ajustée au FDR <0, 05 (Benjamin – Hochberg) ont été considérés comme des DEG. La transformation logarithmique des données a été réglée sur le mode "détection automatique" avec normalisation de la force et poids de précision limma (Vooma). La catégorie d'annotation de plate-forme générée par le NCBI a été sélectionnée pour être affichée sur les résultats. Les résultats ont été obtenus dans un format délimité par des tabulations et exportés vers Microsoft Excel pour une analyse plus approfondie.

Les symboles génétiques des DEG significatifs ont été utilisés pour l'enrichissement fonctionnel de l'ensemble de gènes à l'aide des voies KOBAS-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)58,59,60 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)61 avec Valeur P ajustée au FDR < 0,05 comme seuil de signification. Les résultats ont également été enregistrés sans une valeur P ajustée au FDR < 0,05 pour une analyse comparative.

Les symboles génétiques des DEG ont été utilisés pour construire l'ensemble du réseau PPI à l'aide de STRING (https://string-db.org/). Les DEG ont été annotés avec des termes d'ontologie génique dans les trois catégories principales, processus biologique, fonction moléculaire et composant cellulaire, ainsi que cluster de réseau local (STRING), mots-clés (Uniport) et domaines et caractéristiques protéiques (InterPro)62 avec un support moyen. paramètres de confiance (c'est-à-dire un score combiné > 0,4) et enregistrés sous forme de texte tabulaire court. Par la suite, la topologie du réseau PPI a été exportée directement du site Web STRING vers Cytoscape (v3.9.1)63 (http://www.cytoscape.org/) pour visualisation. Les 50 principaux nœuds hub et les 15 principaux nœuds goulots d'étranglement ont été identifiés à l'aide de l'application plug-in cytoHubba (v0.1) avec la méthode de notation Maximal Clique Centrality (MCC)64. Les nœuds qui ont interagi avec fadD ont été identifiés et étudiés séparément.

Séquences protéiques de FadD de B. japonicum (UniProt : A0A0A3XRM6), RpfB de Xcc (UniProt : Q8P9K5), FadD de E. coli (GenBank : UBF39181.1), Agrobacterium tumefaciens (GenBank : CAD0207327.1), Sinorhizobium meliloti SM11 ( GenBank : AEH77411.1) ont été alignés à l'aide de MUSCLE (MEGA v11)65. L'histoire évolutive a été déduite à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance et du modèle basé sur la matrice JTT66, et la distance d'échange du plus proche voisin a été utilisée comme option d'inférence arborescente et testée par 1000 réplications bootstrap. Des analyses évolutives ont été menées dans MEGA v1165. Les domaines protéiques de FadD de B. japonicum et RpfB de Xcc ont été annotés à l'aide d'InterProScan67. Les structures protéiques tridimensionnelles ont été comparées à l'aide de TM-align20 et de l'outil RRDistMaps dans UCSF Chimera19.

Les fichiers de structure des protéines AlphaFold18 de RpfB (AF-Q8P9K5-F1) et FadD (AF-A0A0A3XRM6-F1) ont été utilisés comme récepteurs, et le fichier SDF du facteur de signalisation diffusé (DSF), cis-11-méthyl-2-dodécénoïque l'acide (PubChem ID : 11469920) a été obtenu à partir de la base de données PubChem et utilisé comme ligand. L'amarrage automatique en aveugle a été effectué à l'aide de CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)21 avec 10 répétitions avec des paramètres inchangés, et des moyennes ont été utilisées pour les interprétations. Les structures ligand-récepteur les plus touchées ont été téléchargées et des captures d'écran des résidus de contact ont été enregistrées pour une analyse plus approfondie. Les interactions récepteur-ligand ont été visualisées à l'aide de Maestro v13.2 gratuit (Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021)68. SWISSDock (http://www.swissdock.ch/docking)23 a également été utilisé avec le même récepteur et le même ligand. Nous avons également utilisé fastDRH (http://cadd.zju.edu.cn/fastdrh/overview)24 pour l'amarrage à grande vitesse avec le moteur d'amarrage AutoDock Vina, et calculé l'énergie MM/PB(GB)SA tronquée par la structure et par -décomposition de l'énergie résiduelle basée sur plusieurs poses. Le complexe récepteur-ligand obtenu à partir de CB-Dock2 a été utilisé comme référence de poche de liaison, puis 10 numéros de pose ont été sélectionnés. Pour la revalorisation de la pose, le champ de force du récepteur ff99SB (avec le modèle d'eau TIP3P) et le champ de force du ligand GAFF2 ont été sélectionnés, et le réglage du rayon de troncature a été maintenu à la valeur par défaut avec toutes les procédures de revalorisation. Les prédictions de points chauds ont été effectuées avec un champ de force ff99SB inchangé et un rayon de troncature par défaut. Pour évaluer les poses d'amarrage, MM/PBSA et MM/GBSA (pour produire une décomposition énergétique sur une base par résidu) ont été soumis séparément. Les résultats obtenus ont été téléchargés et utilisés pour d'autres analyses.

Toutes les simulations de dynamique moléculaire (MD) ont été réalisées à l'aide du package AMBER 16 avec les champs de force ff99SB et GAFF pour les récepteurs RpfB et FadD, et le ligand DSF69. Le module antichambre d'AmberTools a été utilisé pour calculer les charges partielles du ligand en utilisant la fonction semi-empirique AM1-BCC selon le protocole standard70. Les complexes ont été solvatés avec le modèle d'eau TIP3P et neutralisés en ajoutant des ions Na + à l'aide du script d'entrée tLEap du package AmberTools. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été modélisées à l'aide de la méthode d'Ewald à mailles de particules71. L'algorithme SHAKE72 a été appliqué pour contraindre la longueur des liaisons covalentes, y compris les atomes d'hydrogène. Le thermostat Langevin a été mis en œuvre pour équilibrer la température du système à 310 K. Un pas de temps de 2,0 fs a été utilisé dans toutes les configurations MD. Pour les phases de minimisation et d'équilibrage (ensembles NVT et NPT), 100 000 pas et une période de 1 ns ont été utilisés, respectivement. Enfin, des simulations MD classiques de 100 ns, sans contraintes comme ensemble NPT, ont été réalisées pour chacun des complexes récepteur-ligand en utilisant la mécanique moléculaire combinée à la méthode de Poisson-Boltzmann (MM-PBSA) ou de Born généralisée (MM-GBSA) augmentée de le terme de surface accessible aux solvants hydrophobes73,74. Les modèles de solvatation MM-PBSA/GBSA ont été appliqués comme méthode d'état final de post-traitement pour calculer les énergies libres (ΔGpbsa et ΔGgbsa).

L'ensemble de données GSE4143 analysé au cours de la présente étude est disponible sur https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE4143.

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Ce travail a été soutenu par la Japan Society for the Promotion of Science under Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (numéros de subvention 18K19674, 18KK0436 et 20H00562) et l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (numéros de subvention 20wm0225012h0001 et 21fk0108129h0502 ) à FM. Les auteurs remercient les ressources de calcul et le soutien fournis par le professeur Thomas Dandekar et le centre informatique de l'Universität Würzburg avec un financement de la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par le biais de la subvention n° INST 93/878-1 FUGG. Ce travail a été soutenu financièrement par le gouvernement de la Fédération de Russie par le biais du programme de bourses et de chaires ITMO. Les auteurs reconnaissent le projet FSER-2021-0013 et le programme de bourses ITMO pour le soutien de l'infrastructure. Nous remercions Margaret Biswas, PhD, d'Edanz (https://jp.edanz.com/ac) pour l'édition d'un brouillon de ce manuscrit.

Laboratoire de chimioinformatique, Centre scientifique d'infochimie, Université ITMO, Saint-Pétersbourg, Fédération de Russie

Kunal Dutta et Sergueï Chitiakov

Génomique microbienne et écologie, Institut IDEC, Université d'Hiroshima, Higashihiroshima, Japon

Fumito Maruyama

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KD, SS et FM ont rédigé le texte principal du manuscrit et KD a préparé des tableaux et des figures. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Kunal Dutta, Sergey Shityakov ou Fumito Maruyama.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Dutta, K., Shityakov, S. & Maruyama, F. Inactivateur DSF homologue RpfB FadD régulé à la hausse dans Bradyrhizobium japonicum dans des conditions limitant le fer. Sci Rep 13, 8701 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35487-9

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Reçu : 31 décembre 2022

Accepté : 18 mai 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35487-9

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