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May 04, 2023

Régulation translationnelle et protéines

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 616 (2023) Citer cet article

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TREM2 est un récepteur transmembranaire exprimé dans la microglie et les macrophages. Des niveaux élevés de TREM2 dans ces cellules sont associés à des conditions pathologiques liées à l'âge, y compris la maladie d'Alzheimer. Cependant, le mécanisme de régulation sous-jacent à l'expression protéique de TREM2 reste incertain. Dans cette étude, nous découvrons le rôle de la région 5′ non traduite (5′-UTR) du TREM2 humain dans la traduction. Un codon d'initiation en amont (uAUG) dans le 5′-UTR de TREM2 est spécifique à certains primates, y compris les humains. L'expression de la protéine TREM2 conventionnelle, à partir de l'AUG en aval (dTREM2), est réprimée par le 5'-UTR de manière médiée par uAUG. Nous détectons également une isoforme de la protéine TREM2 à partir de uAUG (uTREM2) qui est largement dégradée par les protéasomes. Enfin, le 5′-UTR est essentiel pour la régulation à la baisse de l'expression de dTREM2 en réponse à la privation d'acides aminés. Collectivement, notre étude identifie un rôle régulateur spécifique à l'espèce du 5′-UTR dans la traduction de TREM2.

Le récepteur déclencheur exprimé sur les cellules myéloïdes 2 (TREM2) est une protéine transmembranaire qui agit comme un récepteur de détection des lipides1. TREM2 est principalement exprimé dans la microglie du cerveau. De plus, il est impliqué dans la phagocytose microgliale, l'élagage synaptique et la réponse inflammatoire2,3,4. Il a été démontré que de rares variantes de TREM2 augmentent le risque de maladie d'Alzheimer (MA)5,6. De plus, des mutations homozygotes dans TREM2 conduisent à la maladie de Nasu-Hakola, une maladie rare caractérisée par une démence précoce et des kystes osseux7. Les variantes associées à la maladie de TREM2 altèrent les fonctions spécifiques au substrat et la survie de la microglie8. En revanche, l'expression élevée de TREM2 ou l'activation médiée par les anticorps de TREM2 sauve certains phénotypes de la maladie chez les souris modèles AD9,10. TREM2 est essentiel pour la transition de la microglie homéostatique à un état microglial associé à la maladie11. Son expression marque également les macrophages associés aux tumeurs et les macrophages associés aux lipides12,13. Ainsi, TREM2 a été impliqué dans des conditions liées à l'âge, notamment la MA9,10,11, le cancer12 et l'obésité13. Bien que les fonctions cellulaires de TREM2 aient été démontrées, le mécanisme de régulation de TREM2 reste insaisissable.

Le niveau d'expression approprié des protéines est déterminé par des éléments non codants, tels que la région 5' non traduite (UTR)14. L'AUG en amont (uAUG) est une caractéristique conservée au cours de l'évolution du 5′-UTR entre les humains et les rongeurs15. uAUG réprime l'expression de la protéine dérivée de l'ORF principal en aval (cadre de lecture ouvert) en perturbant le balayage des ribosomes ou en induisant une dégradation de l'ARNm à médiation non-sens16. Des études génétiques et bioinformatiques ont estimé qu'environ 60% de tous les gènes humains codant pour les protéines contiennent uAUG17.

Nous rapportons ici le rôle de uAUG dans le 5′-UTR de TREM2, situé en amont de l'AUG aval (dAUG). Curieusement, il a été déterminé que uAUG était conservé chez les primates, mais pas chez les souris. Le 5′-UTR du TREM2 humain s'est avéré réprimer l'expression du TREM2 conventionnel traduit à partir de dAUG (appelé dTREM2) d'une manière dépendante de uAUG. De plus, nous avons détecté une isoforme TREM2 dérivée de l'uAUG. Notre étude révèle le rôle dépendant de l'espèce du 5′-UTR dans la traduction de TREM2.

Une comparaison de séquence a révélé la présence d'un uAUG, situé à 90 bases en amont du dAUG dans le 5′-UTR de TREM2 chez la plupart des espèces de primates, y compris les humains, mais pas chez les autres mammifères, comme les souris (Fig. 1a, Fig. 1). Ci-après, nous nous référons à la région de 90 bases en amont de dAUG en tant que 5′-UTR pour plus de simplicité. Les ensembles de données de profilage des ribosomes18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38 suggèrent que les ribosomes reconnaissent la moitié initiale du 5′-UTR du TREM2 humain, mais pas de la région correspondante du Trem2 de souris (Fig. 2a supplémentaire, tableau supplémentaire 1). Nous avons examiné l'utilisation relative de uAUG par rapport à celle de dAUG par les ribosomes à l'aide d'un ensemble de données ribo-seq39 et avons constaté que la reconnaissance de uAUG par les ribosomes était d'environ 30 % de celle de dAUG (Fig. 2b supplémentaire). Bien que le type de cellule soit différent, une analyse similaire de la microglie de souris40 a suggéré une fraction inférieure (~ 5%) de Trem2 5′-UTR liée au ribosome (Fig. 2b supplémentaire). Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que uAUG influence la traduction de dTREM2. Nous avons préparé des vecteurs d'expression dans lesquels des séquences de 90 bases de long en amont du dAUG de différentes espèces ont été fusionnées à la séquence codante (CDS) de TREM2 humain (Fig. 1b). Le 5′-UTR du TREM2 humain a diminué de manière significative l'expression de dTREM2 par rapport à celle avec la construction dépourvue du 5′-UTR de TREM2 (Fig. 1c, d). En revanche, aucune diminution de ce type de dTREM2 n'a été observée lorsque le 5'-UTR de souris a été fusionné à ce gène (Fig. 1c, d). Pendant ce temps, le 5′-UTR des chimpanzés et des marmousets a montré des effets intermédiaires. Notamment, une bande protéique plus grande que celle de dTREM2 a été détectée lorsque le 5'-UTR des primates a été fusionné à ce gène (Fig. 1c, appelé uTREM2). La traduction à partir de uAUG devrait produire une isoforme TREM2 avec une extension de 30 résidus d'acides aminés ajoutés à l'extrémité N-terminale de dTREM2. Ces données suggèrent que uAUG joue deux rôles, la répression de l'expression de dTREM2 et la production de uTREM2.

une comparaison de séquences d'ARN de 90 bases en amont de l'AUG en aval (dAUG). Les valeurs uAUG et dAUG sont respectivement surlignées en vert et en gris. La substitution de base est marquée en magenta. b Diagramme schématique des constructions chimériques du CDS TREM2 humain fusionné avec la séquence de 90 bases en amont du dAUG de chaque espèce. c Résultats du Western blot utilisant des cellules HEK293 transfectées avec chaque construction chimère. La flèche rouge indique la bande protéique de uTREM2. d Analyse quantitative de l'expression de la protéine TREM2 dans c. Les résultats du test de Tukey sont présentés. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SD (n = 4).

Pour élucider davantage le rôle de uAUG, nous avons établi des lignées cellulaires isogéniques à l'aide du système Flp-In basé sur HEK293, pour exprimer de manière stable un minigène TREM2 humain complet contenant le 5′-UTR dans lequel uAUG et/ou dAUG ont été mutés ( figure 2a). L'analyse par Western blot des lysats cellulaires totaux a montré une diminution du dTREM2 dérivé de la lignée cellulaire 5′-UTR-WT par rapport à celui de 5′-UTR-none (Fig. 2b, c). En revanche, le niveau d'expression de dTREM2 dérivé de 5′-UTR-Mu était comparable à celui dérivé de 5′-UTR-none (Fig. 2b, c). Aucune bande de protéine TREM2 n'a été observée dans les lignées cellulaires 5'-UTR-Md et 5'-UTR-Mud (Fig. 2b). Ainsi, le niveau d'expression de la protéine dTREM2 a été régulé de manière dépendante de uAUG, alors que l'ARNm de TREM2 dérivé de 5′-UTR-WT, 5′-UTR-Md et 5′-UTR-Mud n'a montré aucune réduction par rapport à au niveau de 5′-UTR-aucun (Fig. 2d). Par conséquent, uAUG est essentiel pour la répression de dTREM2 par le 5′-UTR au niveau traductionnel.

a Diagramme schématique d'une série de constructions de minigènes fl-TREM2 avec ou sans le 5′-UTR (région non traduite). Les codons d'initiation mutés sont indiqués en rouge. Des cellules HEK293 exprimant de manière stable ces minigènes ont été établies à l'aide du système Flp-In. b Les lysats cellulaires totaux de chaque lignée cellulaire stable ont été résolus par SDS-PAGE et sondés avec un anticorps anti-TREM2. c Quantification des résultats de Western Blot. Les données représentent la moyenne ± SD (n = 3, test de Tukey). d Niveaux d'ARNm de TREM2 dans chaque lignée cellulaire normalisés à l'ACTB. Les barres d'erreur indiquent la moyenne ± SD (n = 3, test de Tukey). Aucune différence significative n'a été détectée entre les cellules 5'-UTR-none et 5'-UTR-WT.

Comme le montre la figure 2b, uTREM2 pouvait à peine être détecté dans les lysats cellulaires totaux des cellules 5′-UTR-WT et 5′-UTR-Md. Nous avons ensuite étudié les conditions optimales pour détecter l'expression de uTREM2. L'utilisation de 0, 1% de Triton-X-100 pour la lyse cellulaire et d'un anticorps contre l'extrémité C-terminale de TREM2 pour l'immunotransfert a facilité la détection de la bande protéique correspondant à uTREM2 dans les cellules 5′-UTR-WT (flèche rouge, Fig supplémentaire 3). De plus, uTREM2 a été clairement détecté lorsque la fraction protéique liée à la membrane a été utilisée (Fig. 3a). Les cellules THP-1 ont produit une bande protéique d'uTREM2 endogène uniquement lorsque ces cellules ont été traitées avec du phorbol-myristate-acétate (PMA) (Fig. 3 supplémentaire). La bande uTREM2 a été détectée dans la fraction protéique liée à la membrane de 5′-UTR-WT, mais pas dans les autres cellules (Fig. 3a).

a Des fractions protéiques liées à la membrane de lignées cellulaires stables ont été soumises à une analyse Western blot. La flèche rouge indique la bande protéique de uTREM2. APP a été utilisé comme contrôle de chargement. b Schéma d'immunoprécipitation et traitement à la PNGase F. c Immunoprécipitation à l'aide d'anticorps anti-TREM2 dans les cellules indiquées. Les flèches rouges indiquent uTREM2. d Les cellules 5′-UTR (région non traduite)-aucune, 5′-UTR-WT, 5′-UTR-Mu et 5′-UTR-Md ont été soumises à une immunoprécipitation suivie d'une déglycosylation avec la PNGase F. e TREM2 exprimé en THP -1 cellules ont été immunoprécipitées suivies d'un traitement avec la PNGase F. Les flèches rouges et bleues indiquent la bande protéique de uTREM2 et de uTREM2 déglycosylé, respectivement (d, e).

Pour examiner l'intégrité de uTREM2, des cellules 5′-UTR-none, 5′-UTR-WT et THP-1 ont été immunoprécipitées avec un anticorps contre l'ectodomaine de dTREM2 et sondées avec un autre anticorps contre son extrémité C-terminale (Fig. 3b ). Les cellules 5′-UTR-WT et THP-1 ont donné une bande protéique d'uTREM2 dans la fraction immunoprécipitée (flèches rouges, Fig. 3c). Cela a également indiqué que uTREM2 partage des séquences d'ectodomaine et C-terminal avec dTREM2. Pour confirmer si uTREM2 contient des peptides N-terminaux spécifiques, la bande protéique de uTREM2 des cellules 5′-UTR a été soumise à une analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) après immunoprécipitation. Nous avons par conséquent détecté un peptide, MPDPLFSAVQGK, qui correspondait à l'extrémité N-terminale unique de uTREM2 (Fig. 4 supplémentaire), soutenant notre hypothèse selon laquelle la traduction à partir de uAUG conduit à la production de la protéine uTREM2.

TREM2 est soumis à une glycosylation en tant que modification post-traductionnelle41. Pour vérifier que uTREM2 était glycosylé, les produits immunoprécipités dérivés de nos lignées cellulaires stables ont été déglycosylés avec la PNGase F (Fig. 3b). En l'absence de PNGase F, les immunoprécipités des cellules 5′-UTR-WT et 5′-UTR-Md ont montré une bande protéique de uTREM2 (flèches rouges, Fig. 3d). Ainsi, uTREM2 était exprimé dans les cellules 5′-UTR-Md, et l'absence de sa détection dans les expériences précédentes pourrait être due au faible niveau de uTREM2. Après le traitement à la PNGase F, le 5′-UTR-none et le 5′-UTR-Mu présentaient des schémas similaires (Fig. 3d). Notamment, une bande protéique unique a été détectée dans les cellules 5′-UTR-WT et 5′-UTR-Md, qui était absente dans les cellules 5′-UTR-none et 5′-UTR-Mu et devrait être dérivée de la uAUG (Fig. 3d, indiqué par des flèches bleues), ce qui implique que uTREM2 est soumis à une glycosylation (Fig. 3d). De plus, les cellules THP-1 présentaient un motif de bande protéique similaire à celui de 5′-UTR-WT (Fig. 3e). Ces résultats suggèrent que uTREM2 est glycosylé.

Pour vérifier que uTREM2 est traduit à partir de uAUG, nous avons préparé une série de minigènes mutants fl-TREM2 avec un codon stop dans le 5′-UTR (Fig. 4a). Comme uAUG est le premier codon de uTREM2, la substitution comprenant les 6e et 23e codons de uAUG a été notée F6X et C23X, respectivement. La bande protéique d'uTREM2 a été abolie dans les minigènes 5′-UTR-WT-F6X et 5′-UTR-WT-C23X (flèches rouges, Fig. 4b). Simultanément, le niveau d'expression de dTREM2 a été partiellement restauré avec ces constructions, suggérant qu'une traduction continue de uAUG à dAUG est nécessaire pour la régulation répressive de la traduction de TREM2. Le niveau de protéine dTREM2 dérivé des minigènes 5′-UTR-Mu-F6X et 5′-UTR-WT-C23X était comparable à celui du minigène 5′-UTR-Mu (Fig. 4b). De plus, des bandes protéiques d'uTREM2 et de dTREM2 ont été détectées avec le minigène 5′-UTR-Md ; cependant, aucune bande protéique n'a été détectée avec les minigènes 5'-UTR-Md-F6X et 5'-UTR-Md-C23X (Fig. 4b). Cela indique fortement que les deux bandes étaient dérivées de la traduction initiée par uAUG du minigène 5′-UTR-Md.

a Les lignes bleues représentent les codons stop introduits entre uAUG et AUG en aval (dAUG). F6X et C23X représentent des codons stop introduits dans le 5′-UTR (région non traduite) de TREM2. b Les fractions liées à la membrane de cellules HEK293 transfectées avec ces minigènes ont été analysées par western blot. APP a été utilisé comme contrôle de chargement. Les flèches rouges indiquent uTREM2. c Diagramme schématique des mutants de décalage de cadre. Un décalage de cadre dans les minigènes a été induit par une insertion d'un seul nucléotide au milieu du 5′-UTR. d Les fractions membranaires de cellules HEK293 transfectées avec des minigènes de décalage de cadre ont été soumises à une analyse Western blot à l'aide d'un anticorps anti-TREM2.

Nous avons également préparé un minigène de pleine longueur avec un 5'-UTR dans lequel un décalage de cadre a été introduit par une insertion d'un seul nucléotide (Fig. 4c, appelée FS). L'expression de uTREM2 a également été perturbée par le minigène 5′-UTR-WT-FS (Fig. 4d). Remarquablement, le niveau d'expression de dTREM2 dérivé de 5′-UTR-WT-FS était comparable à celui de 5′-UTR-WT (Fig. 4d), indiquant que la mutation par décalage de cadre n'augmentait pas l'expression de dTREM2. Cela contraste avec l'observation ci-dessus (Fig. 4b) dans laquelle dTREM2 de 5′-UTR-WT a été augmenté en introduisant des mutations ponctuelles (F6X ou C23X). Ces observations sont en accord avec le fait que la traduction continue de uAUG qui passe par dAUG pourrait contribuer à la répression de dTREM2. Les bandes protéiques de uTREM2 et dTREM2 ont été abrogées avec le minigène 5′-UTR-Md-FS (Fig. 4d). Associés à l'observation illustrée à la figure 4b, ces résultats soulèvent la possibilité que uTREM2 soit partiellement soumis à une digestion au niveau du peptide signal et produise la protéine dTREM2. Il n'y avait aucune différence dans la localisation intracellulaire de TREM2 parmi ces mutants (Fig. 5 supplémentaire).

Ensuite, nous avons étudié l'importance du 5′-UTR de TREM2 dans la physiologie cellulaire en comparant la réponse de l'expression de TREM2 au stress cellulaire (Fig. 5a, Fig. 6a supplémentaire). Les conditions de stress cellulaire testées dans cette étude étaient les suivantes : (i) privation d'acides aminés ; (ii) la bafilomycine A1 (BafA1), un inhibiteur de la H+-ATPase vacuolaire ; (iii) un inhibiteur du protéasome, MG132 ; (iv) l'acide polyinosinique-polycytidylique (polyI:C), un analogue synthétique de l'ARN double brin (ARNdb); et (v) le lipopolysaccharide (LPS), un médiateur de l'inflammation. Le niveau d'expression de dTREM2 dérivé des cellules 5'-UTR-none n'a pas été modifié dans les conditions examinées (Fig. 5b). Curieusement, une bande légèrement plus petite que dTREM2 est apparue spécifiquement dans les cellules 5′-UTR-WT avec traitement MG132 (Fig. 5a), suggérant la présence d'une protéine TREM2 dérivée de 5′-UTR qui a été complètement dégradée par le protéasome. De plus, le niveau d'expression de dTREM2 dans les cellules 5′-UTR-WT a été significativement réduit par la privation d'acides aminés et le traitement polyI: C (Fig. 5a, c). Le traitement par BafA1 et LPS n'a pas modifié les niveaux d'expression de TREM2 (Fig. 5a, c). Cependant, un traitement simultané avec la privation d'acides aminés et BafA1 a réduit le niveau d'expression de dTREM2 dans le 5′-UTR-WT (Fig. 5d), démontrant que la réduction de dTREM2 médiée par la privation d'acides aminés n'était pas due à une dégradation accrue par autophagie. Le niveau d'expression de dTREM2 dans les cellules 5′-UTR-Mu n'a pas été modifié par la privation d'acides aminés, alors que celui dans les cellules 5′-UTR-Md a été diminué (Fig. 5e), indiquant que uAUG est essentiel pour la régulation à la baisse des deux uTREM2 et dTREM2 médiée par la privation d'acides aminés. La protéine dTREM2 endogène dans les cellules THP-1 a présenté une régulation à la baisse similaire lors de la privation d'acides aminés (Fig. 6b supplémentaire). Enfin, nous avons analysé la localisation intracellulaire de TREM2 par immunofluorescence. Alors que le signal TREM2 des lignées cellulaires 5′-UTR-none et 5′-UTR-Mu a été obtenu, celui des cellules 5′-UTR-WT et 5′-UTR-Md était presque indétectable (Fig. 7 supplémentaire) . Nous avons ainsi exprimé de manière transitoire les minigènes TREM2 et observé la localisation de TREM2. Bien que l'expression de TREM2 soit encore faible dans les cellules transfectées avec 5′-UTR-Md, le schéma de localisation était similaire parmi les quatre constructions, avec peu de changements induits par différents traitements (Fig. 8 supplémentaire).

a Les lignées cellulaires 5′-UTR-none et WT ont été exposées à un stress cellulaire. Les fractions de protéines liées à la membrane ont été soumises à un transfert Western en utilisant les anticorps indiqués. La flèche rouge indique uTREM2 (isoforme de la protéine TREM2 à partir de l'AUG en amont). b, c Quantification de TREM2 en aval (dTREM2) à partir de cellules 5′-UTR-none (b) et de cellules 5′-UTR-WT (c) sur la base des résultats de Western blot. Les différences par rapport au témoin non traité ont été analysées en utilisant le test de Dunnett. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SD (n = 4). d, e Des lignées cellulaires stables ont été cultivées dans un milieu de famine avec de la bafilomycine A1. Les lysats cellulaires totaux ont été utilisés pour confirmer les effets du traitement.

Comme le montre la figure 5a, le traitement par MG132 a entraîné une bande légèrement plus petite que dTREM2 dans les cellules 5′-UTR-WT, mais pas 5′-UTR-none. Cette bande a également été détectée dans les cellules 5′-UTR-Md lors du traitement au MG132 (Fig. 6a), suggérant fortement qu'elle était dérivée de uAUG. Une bande similaire a été détectée dans la fraction membranaire des cellules THP-1 traitées au MG132, bien qu'à un niveau inférieur (Fig. 6b). Ainsi, il apparaît que la majorité des produits dérivés de l'uAUG sont dégradés par les protéasomes.

a Les lysats cellulaires totaux de lignées cellulaires stables ont été traités avec MG132 et analysés par western blot. L'ubiquitine (Ub) a été utilisée comme témoin positif pour le traitement au MG132. Les flèches rouges et bleues indiquent la bande protéique d'uTREM2 intact et une forme sensible au protéasome d'uTREM2, respectivement. b Analyse Western blot de la fraction protéique liée à la membrane des cellules traitées au MG132. c Hypothèse de travail du traitement uTREM2 (isoforme de la protéine TREM2 à partir de uAUG). Une grande partie de l'uTREM2 dérivé de l'uAUG est dégradée par le protéasome. La fraction uTREM2 restante est glycosylée et clivée pour produire dTREM2 (isoforme de la protéine TREM2 à partir de l'AUG en aval).

Dans cette étude, nous avons révélé un effet régulateur répressif sur la traduction de TREM2 humain médiée par son 5′-UTR. Nous avons également montré l'implication du 5′-UTR dans la réponse à la privation d'acides aminés. Comme ces caractéristiques dépendent de uAUG, qui est partagé par certains primates, nos résultats mettent en évidence les caractéristiques spécifiques à l'espèce de TREM2. Nous avons constaté que la régulation de la traduction de TREM2 médiée par uAUG est conservée chez certains primates, mais pas chez la souris (Fig. 1). Bien que l'on s'attende à ce que les protéines TREM2 humaines et murines aient des fonctions conservées, il est probable que ces deux protéines soient soumises à des mécanismes de régulation divergents. Par exemple, nous avons récemment rapporté que TREM2 subit l'épissage alternatif de l'exon 342. Un transcriptome à noyau unique a révélé des réponses conservées et non conservées entre la microglie humaine et la souris dans le contexte de l'AD43. Ainsi, nos découvertes pourraient contribuer à la compréhension des aspects spécifiques à l'espèce de la microglie. Récemment, une régulation à la hausse de la traduction de Trem2 dans un modèle murin de MA a été rapportée44. Étant donné que uAUG de TREM2 qui réprime la traduction de dTREM2 est absent chez la souris Trem2, l'activation de la traduction de Trem2 chez les souris modèles AD peut se produire par un mécanisme distinct de celui que nous avons décrit. Une enquête plus approfondie est nécessaire pour déterminer l'importance de ces résultats chez les patients atteints de MA. Nos analyses de mutation ont également suggéré que la traduction continue de uAUG à dAUG est impliquée dans la répression de l'expression de dTREM2 (Fig. 4), ce qui peut être interprété comme une compétition entre uAUG et dAUG pour l'initiation de la traduction. Nous avons également constaté que les niveaux de dTREM2 sont réduits par la privation d'acides aminés et le traitement poly (I: C), en fonction de l'uAUG (Fig. 5), suggérant l'implication de déterminants supplémentaires45. L'utilisation de dAUG pourrait être limitée par plusieurs facteurs en présence d'uAUG, y compris des perturbations du balayage ribosomique médiées par l'initiation de la traduction au niveau de l'uAUG, la structure secondaire du 5′-UTR et des facteurs agissant en trans qui se lient au 5′ -UTR46. Élucider le mécanisme précis de la répression médiée par 5′-UTR fournirait une stratégie pour moduler l'expression de TREM2.

En plus de la répression traductionnelle, le TREM2 5′-UTR est également impliqué dans l'expression de uTREM2. L'extension de 30 résidus à l'extrémité N-terminale de uTREM2 augmente la longueur du peptide signal. De manière inattendue, nous avons observé une bande protéique de dTREM2 avec celle de uTREM2 dans les cellules 5′-UTR-Md (Fig. 4b). Les deux bandes ont disparu lorsqu'un codon stop a été introduit en aval de l'uAUG (Fig. 4b). Nous proposons que la région N-terminale de uTREM2 soit clivée au même site que le peptide signal de dTREM2, entraînant la production de dTREM2. L'extension N-terminale d'uTREM2 allonge le peptide signal de 18 à 48 acides aminés. Bien que la longueur moyenne des peptides signal chez les eucaryotes soit de 22 résidus47, plusieurs gènes ont un long peptide signal de 40 résidus ou plus48. Remarquablement, nous avons détecté une bande protéique rappelant l'uTREM2 déglycosylé, spécifiquement dans les cellules 5′-UTR-WT et 5-UTR-Md lors de l'inhibition du protéasome (Fig. 6a, Fig. 9 supplémentaire). Nous supposons qu'une fraction majeure d'uTREM2 est rapidement dégradée par les protéasomes et que la fraction restante est glycosylée et clivée pour produire dTREM2 (Fig. 6c). Il existe un autre exemple de protéine membranaire glycosylée (US11) qui conserve son peptide signal en raison de son clivage retardé49. Le long peptide signal dans uTREM2 pourrait avoir entraîné la dégradation protéasomique préférentielle de uTREM2 et un clivage retardé du peptide signal. Bien que uTREM2 puisse être considéré comme un intermédiaire d'une voie alternative de production de dTREM2, ou comme un sous-produit de la répression de dTREM2 médiée par uAUG, d'autres études sont nécessaires pour déterminer sa fonctionnalité.

En conclusion, cette étude a révélé le rôle du 5′-UTR dans la traduction du TREM2 humain. Comme le mécanisme de régulation médié par uAUG de TREM2 n'est pas conservé chez la souris, notre étude souligne l'importance des études utilisant des cellules d'origine humaine pour obtenir de nouvelles informations sur les troubles liés à TREM2. La régulation de TREM2 au niveau traductionnel est également importante, ce qui pourrait être négligé par les analyses de transcriptome.

Les amorces utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. Tous les plasmides modifiés ont été soumis à un séquençage d'ADN.

Le 5′-UTR des chimpanzés, des ouistitis et des souris a été amplifié à partir de l'ADN génomique (obtenu à partir de HSP-239, HSCj-11050 et 91062702, respectivement) à l'aide d'amorces spécifiques. Des fragments du 5′-UTR et du TREM2 CDS42 humain ont été combinés par PCR, digérés avec BamHI et XbaI, et clonés dans le site BamHI-XbaI de pcDNA3.1 Hygro (+) (Invitrogen).

Une série de séquences 5′-UTR de TREM2 humain avec un uAUG et/ou dAUG muté a été fusionnée dans le minigène fl-TREM2, comme décrit précédemment51. Pour obtenir le 5′-UTR avec ou sans mutation dans uAUG et/ou dAUG, le CDS TREM2 fusionné en 5′-UTR et le minigène fl-TREM2 ont été utilisés comme matrices de PCR pour amplifier la région du 5′-UTR au milieu de l'intron 1. Le remplacement d'ATG par GTG a ensuite été effectué à l'aide d'amorces de PCR. Ces deux fragments ont été combinés par amplification médiée par PCR, digérés avec Nhel et HindIII, et clonés dans le site Nhel-HindIII du minigène fl-TREM2.

Des substitutions F6X et C23X (les nombres de résidus ont été comptés à partir de l'uAUG) et une insertion par décalage de cadre d'un seul nucléotide ont été introduites par PCR en utilisant des amorces portant la mutation correspondante. Chaque fragment a été digéré par Nhel et HindIII puis cloné dans le site Nhel-HindIII du minigène fl-TREM2 contenant le 5'-UTR de TREM2. La PCR pour la construction de plasmide a été réalisée en utilisant KOD plus neo (TOYOBO).

Les cellules HEK293 et ​​HeLa ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Sigma) et de pénicilline/streptomycine (Wako) à 37 °C avec 5 % de CO2. La lignée cellulaire HSCj-110, dérivée de Callithrix jacchus (JCRB1655), la lignée THP-1 d'origine humaine et la lignée cellulaire HSP-239 dérivée de Pan troglodytes (JCRB1165), ont été obtenues à partir de JCRB50 et maintenues dans du milieu RPMI 1640 ( Supplément GlutaMAX, Thermo Fisher Scientific) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de pénicilline/streptomycine à 37 °C avec 5 % de CO2. Une lignée cellulaire stable exprimant le minigène fl-TREM2 sans le 5′-UTR (5′-UTR-none) a été précédemment établie51. Des lignées cellulaires exprimant de manière stable les minigènes fl-TREM2 (5′-UTR-WT, Mu, Md et Mud) ont été établies à l'aide du système Flp-In comme décrit dans notre étude précédente51. L'intégration des minigènes fl-TREM2 a été confirmée par PCR, en utilisant des amorces spécifiques au fragment.

Les cellules ont été traitées dans les conditions suivantes : DMEM (high glucose) avec du pyruvate de sodium, sans acides aminés (Wako) pendant 4 h, 100 nM de bafilomycine (Merck) pendant 4 h, 10 μM MG132 (Sigma) pendant 12 h, 2 μg mL −1 Poly(I:C) (Tocris Bioscience) pendant 24 h avec Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) et 1 μg mL−1 LPS (Sigma) pendant 6 h. Les cellules HEK293 ont été ensemencées sur des plaques à 12 puits avant le jour de la transfection de l'ADN plasmidique. En règle générale, 0, 5 μg de plasmide ont été transfectés dans des cellules HEK293 à l'aide de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) et récoltés 48 h après la transfection du plasmide. La Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) a été utilisée pour la transfection des plasmides dans les cellules HeLa.

La purification de l'ARN total et l'analyse quantitative ont été effectuées comme décrit précédemment52. ACTB a été utilisé comme gène de référence.

Le fractionnement cellulaire et le transfert Western ont été effectués comme dans les études précédentes42. Les images de buvardage ont été capturées à l'aide d'un luminographe III (ATTO). Les intensités des signaux ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji (NIH). Comme le montre la figure 5, la membrane a été colorée avec une solution de Ponceau S pour mesurer la protéine totale avant le blocage et le traitement par anticorps. Les anticorps utilisés pour le transfert Western sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 3. Les images de transfert complet sont présentées dans la Fig. 10 supplémentaire.

L'identification des protéines a été effectuée comme décrit précédemment 53 avec des modifications mineures. En bref, les échantillons d'immunoprécipitation ont été séparés par SDS-PAGE et les gels ont été colorés avec le kit Silver Stain MS (Wako). Les bandes de protéines ont été excisées du gel et décolorées avec une solution de décoloration. Ensuite, le gel a été réduit avec du dithiothréitol 25 mM et alkylé avec de l'iodoacétamide à 1 % (p/v) dans du bicarbonate d'ammonium 25 mM. Chaque gel a été trypsinisé pendant une nuit à 37 °C dans un tampon de digestion [bicarbonate d'ammonium 50 mM, 0,01 % (p/v) ProteaseMax Surfactant (Promega), 1,33 μg ml−1 Trypsin (Promega) et 1,33 μg ml−1 Lysyl Endopeptidase ( Wako)], et le surnageant a été conservé. Les peptides ont été extraits des portions de gel excisées avec de l'acide trifluoroacétique à 2,5 % après agitation pendant 15 minutes. Après digestion, les peptides résultants ont été dessalés et concentrés à l'aide de StageTips (Thermo Fisher). Le programme gradient utilisant les phases mobiles A et B (acétonitrile contenant 0,1 % d'acide formique) avait la séquence suivante : 0 % B (0 min) – 30 % B (50 min) – 100 % B (51 min) – 100 % B ( 60 mn). Les données LC-MS/MS ont été traitées avec Proteome Discoverer version 2.4 (Thermo Fisher Scientific). Nous avons ajouté la séquence d'acides aminés de uTREM2 à la base de données Uniprot (version 04/2017, avec 20 198 séquences).

L'immunofluorescence a été réalisée selon les méthodes décrites dans notre étude précédente42. En bref, des cellules HeLa et des lignées cellulaires stables HEK Flp-In ont été cultivées dans une lame à huit puits (WATSON). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (Wako) pendant 10 min et traitées avec du Triton à 0,1 % pendant 5 min. Après 3 h d'incubation avec l'anticorps anti-TREM2 C-term, les cellules ont été traitées avec Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin Ig (H+L) ou Alexa Fluor 568 âne anti-lapin IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific ) pendant 1h. Les cellules ont été montées avec du milieu de montage Vectashield avec DAPI (VECTOR LABORATORIES). Les images cellulaires ont été obtenues par microscopie confocale (LSM710; Carl Zeiss).

Pour l'immunoprécipitation, un anticorps TREM2 anti-humain de chèvre (R&D, AF1828) a été mélangé à des billes magnétiques conjuguées à la protéine G (Thermo Fisher Scientific). Les cellules ont été lysées dans du Triton-X à 0, 1% dans du PBS avec un inhibiteur de protéase 1 × (Roche), suivi d'une rotation à 4 ° C pendant 30 min. Après centrifugation (16 000 × g à 4 °C pendant 10 min), le surnageant a été pré-nettoyé avec des billes magnétiques conjuguées à la protéine G à 4 °C pendant 2 h et immunoprécipité avec des billes magnétiques conjuguées à un anticorps anti-TREM2 ou un isotype contrôle en le faisant tourner pendant une nuit à 4 °C. Les billes ont été lavées trois fois avec du Triton-X à 0,1 % dans du PBS. Les immunoprécipités ont été élués des billes dans du tampon Gly-HCl 0,1 M (pH 2,5, contenant 0,15 mM de NaCl). Un anticorps de lapin anti-TREM2 (CST, D8I4C) a été utilisé comme anticorps primaire pour le Western blot. TrueBlot anti-IgG HRP (ROCKLAND) a été utilisé comme anticorps secondaire.

Les produits immunoprécipités avec des anticorps anti-TREM2 ont été soumis à une déglycosylation à l'aide de la PNGase F (NEB) selon les instructions du fabricant.

Le logiciel EXCEL Toukei (ESUMI Co., Ltd.) a été utilisé pour l'analyse statistique. Tous les graphiques ont été produits à l'aide du logiciel R (version 3.6.1, https://www.r-project.org/). Les tailles d'échantillons sont définies dans les légendes des figures. Les mesures ont été prises à partir de réplicats biologiques distincts représentant des transfections ou des traitements cellulaires indépendants. Les barres d'erreur représentent l'écart type (SD). Tous les tests statistiques étaient bilatéraux et sont décrits dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources sont disponibles dans les données supplémentaires 1. Les transferts complets sont présentés dans les informations supplémentaires. Toutes les autres données sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

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Nous remercions le Dr Jun-ichi Satoh pour sa supervision et ses commentaires utiles et Mme Minako Sato, Mme Hazuki Goshima et Mme Yuka Oda pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions pour la recherche scientifique du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie (MEXT) à YK (16K09683, 19K07982, 16K07043, 20K07876) et MY (19J15024, 21K20700), et par le Dementia Drug Resource Development Center Project (DRC), MEXT, Japon (S1511016). MY a été soutenu par une subvention pour les boursiers JSPS (numéro de subvention JP19J15024) et une bourse de recherche Nagai Memorial de la Pharmaceutical Society of Japan.

Département de bioinformatique et de neuropathologie moléculaire, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokyo, 204-8588, Japon

Motoaki Yanaizu, Haruka Adachi et Yoshihiro Kino

Department of RNA Pathobiology and Therapeutics, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokyo, 204-8588, Japon

Motoaki Yanaizu et Yoshihiro Kino

Département de biochimie, Université pharmaceutique Meiji, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokyo, 204-8588, Japon

Makoto Araki et Kenji Kontani

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MY et YK ont conçu et conçu les expériences et rédigé le manuscrit. MY et HA ont réalisé des expériences. MA et KK ont effectué des procédures de spectrométrie de masse. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit.

Correspondance à Yoshihiro Kino.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Dileep Kumar et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Gracjan Michlewski et Gene Chong.

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Réimpressions et autorisations

Yanaizu, M., Adachi, H., Araki, M. et al. Régulation traductionnelle et capacité de codage des protéines de la région 5 'non traduite du TREM2 humain. Commun Biol 6, 616 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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Reçu : 08 septembre 2022

Accepté : 30 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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