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Jul 30, 2023

Cils

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8205 (2023) Citer cet article

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Les cils primaires sont des organites conservés qui intègrent des signaux extracellulaires dans les signaux intracellulaires et sont essentiels pour divers processus, y compris le développement cellulaire et les réponses de réparation. Les déficits de la fonction ciliaire provoquent des maladies humaines multisystémiques appelées ciliopathies. Dans l'œil, l'atrophie de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une caractéristique commune de nombreuses ciliopathies. Cependant, les rôles des cils RPE in vivo restent mal compris. Dans cette étude, nous avons d'abord découvert que les cellules RPE de souris ne forment que de manière transitoire des cils primaires. Nous avons ensuite examiné le RPE dans le modèle murin du syndrome de Bardet-Biedl 4 (BBS4), une ciliopathie associée à la dégénérescence rétinienne chez l'homme, et avons constaté que la ciliation dans les cellules RPE mutantes BBS4 est perturbée tôt au cours du développement. Ensuite, en utilisant un modèle de blessure induite par laser in vivo, nous avons constaté que les cils primaires de l'EPR se réassemblent en réponse à une blessure au laser pendant la cicatrisation de l'EPR, puis se désassemblent rapidement une fois la réparation terminée. Enfin, nous avons démontré que l'appauvrissement spécifique à l'EPR des cils primaires dans un modèle murin conditionnel de perte de cils favorisait la cicatrisation des plaies et augmentait la prolifération cellulaire. En résumé, nos données suggèrent que les cils RPE contribuent à la fois au développement et à la réparation de la rétine et fournissent des informations sur les cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies dégénératives RPE plus courantes.

L'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est une monocouche polarisée de cellules essentielles au développement des photorécepteurs et à la fonction visuelle, car son interaction avec les photorécepteurs est essentielle au maintien de la rétine. Par conséquent, le dysfonctionnement de l'EPR est lié à de nombreuses maladies, dont la dégénérescence maculaire1,2,3,4,5. La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est l'une des principales causes de cécité irréversible chez les personnes âgées6,7,8. Malgré des progrès considérables dans le traitement de la DMLA humide, il n'existe aucune stratégie efficace pour traiter la DMLA sèche, qui comprend 90 % de tous les cas diagnostiqués9,10,11. La perte d'EPR est supposée être une cause majeure de DMLA12,13,14,15. Comprendre le potentiel de régénération endogène de l'EPR pourrait révéler de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour des maladies telles que la DMLA sèche16,17,18,19.

Le cil primaire est une structure solitaire à base de microtubules présente dans presque tous les types de cellules de mammifères post-mitotiques20,21,22,23,24,25,26. Ce petit appendice cellulaire peut détecter les changements dans l'environnement externe et transformer ces signaux en cascades de signalisation intracellulaire. Parce qu'ils sont essentiels à l'embryogenèse normale, la perturbation des cils primaires provoque des malformations du développement dans presque tous les systèmes d'organes20,27,28,29,30,31,32. Les cils primaires jouent également un rôle important dans les processus post-développement tels que la prolifération cellulaire et la réparation des plaies20,33,34,35,36,37,38,39. Les mutations dans les gènes nécessaires à la formation et à la fonction des cils provoquent un éventail de maladies humaines, collectivement appelées ciliopathies, qui se présentent comme des troubles cliniques tels que la polykystose rénale, l'obésité, la dégénérescence rétinienne et l'atrophie de l'EPR40,41,42,43,44,45. IFT88 fait partie du complexe de transport intraflagellaire nécessaire à la ciliogenèse46. La ciliopathie prototypique du syndrome de Bardet-Biedl (BBS) résulte de mutations dans les gènes BBS. Produits pour plusieurs gènes BBS pour le BBSome, un important complexe protéique multimérique critique pour la régulation de la composition de signalisation du compartiment ciliaire47,48,49,50,51,52. Le membre de BBSome, BBS4, joue de multiples rôles dans la prolifération cellulaire et la maintenance des cils53,54.

De plus en plus de preuves soutiennent le rôle des cils dans la coordination de la prolifération et de la migration des cellules, qui, lorsqu'elles sont dysfonctionnelles, peuvent entraîner des défauts de cicatrisation33,34,37,55,56,57,58,59. Parce que le cil pointe dans la direction migratoire, on pense que les cils primaires peuvent participer aux processus cycliques de la migration cellulaire directionnelle pendant la réparation tissulaire37,58. Par exemple, dans les cellules de la peau, les cils primaires jouent un rôle majeur dans le contrôle de la prolifération lors de la cicatrisation des plaies60. Il est bien connu que les cils défectueux améliorent la prolifération cellulaire au cours de la pathogenèse de divers troubles33,56,61. Dans un autre exemple, la suppression d'un gène de transport intraflagellaire différent, IFT20, dans les cellules du canal collecteur du rein de souris entraîne la prolifération et le développement de kystes qui conduisent à la maladie rénale kystique62.

Les lignées cellulaires RPE immortalisées ont été largement utilisées comme système modèle pour étudier les complexes protéiques des cils et la ciliogenèse 22,38. Cependant, les rôles des cils RPE in vivo sont restés largement inconnus. Récemment, on a découvert que les cils étaient nécessaires à la maturation de l'EPR63,64. Étant donné que les cils RPE des rongeurs sont résorbés après la maturation64,65, il n'est pas clair si le renouvellement des cils contribue aux activités de réparation et à la régénération des RPE à l'âge adulte.

Ici, nous avons étudié le rôle des cils primaires dans les réponses prolifératives et réparatrices de l'EPR de souris à l'ablation au laser ciblée. Nous montrons que BBS4 joue un rôle important dans la ciliogenèse RPE in vivo. En utilisant des souris transgéniques et la technologie d'immunofluorescence, nous fournissons également des preuves que les cils primaires de l'EPR de souris adulte sont réassemblés en réponse à une blessure induite par laser pendant la cicatrisation. En outre, nous caractérisons la fonction des cils primaires, en utilisant un allèle conditionnel de Ift88 pour ablater les cils et leur formation potentielle dans l'EPR postnatal. Nous avons démontré que l'élimination des cils favorise la réparation des tissus en améliorant la prolifération cellulaire.

Des études antérieures ont rapporté que les cils primaires de l'EPR de rongeur se désassemblent après la maturation rétinienne64,65. Cependant, le moment du démontage des cils est largement différent chez les rats par rapport aux souris pigmentées C57BL/664,65. Alors que plus de 60% des cellules RPE contiennent des cils chez les rats le lendemain de la naissance le premier jour postnatal (P1), il n'y a que quelques RPE ciliés trouvés chez les souris C57BL6. Nous voulions savoir si cela était dû à une différence d'espèce entre les souris et les rats. Pour étudier plus avant la mesure dans laquelle les cils sont résorbés dans l'EPR de souris dans une autre souche, nous avons analysé l'EPR de souris albinos CD1 dans des préparations de rétine à plat de P0 à P21 (Fig. 1A). Les cils primaires ont été identifiés par immunofluorescence pour Arl13b, un marqueur membranaire des cils couramment utilisé57,66. Les jonctions serrées ont été visualisées par immunofluorescence pour ZO-167. Les cellules RPE avec cils primaires étaient abondantes au jour postnatal 0 (P0), mais leur fréquence était significativement diminuée chez les animaux âgés de 3 semaines (P21), lorsque la rétine était considérée comme largement mature. Fait intéressant, le pourcentage de cellules ciliées dans la zone centrale (près du nerf optique) était le plus élevé à P7 (environ 80 %), alors que seuls quelques RPE ciliés ont été détectés à P7 chez des souris pigmentées64. À P14, la réduction des cellules ciliées était significativement plus importante dans l'EPR central que dans l'EPR périphérique. Les cils primaires étaient indétectables dans les RPE périphériques et centraux à P21, ce qui suggère que la plupart des cellules RPE avaient perdu leurs cils ou que la longueur de leurs cils était réduite ou qu'elles n'étaient plus Arl14b positives (Fig. 1B). Des modifications de la longueur ciliaire colorée par Arl13b ont accompagné la résorption des cils : la longueur moyenne a diminué de 1,4 μm à P0 à 0,2 μm à P14 dans la zone centrale et de 1,1 μm à P0 à 0,6 μm à P14 dans la zone périphérique (Fig. 1C). L'analyse des zones cellulaires RPE à différents stades de développement a montré une tendance à une augmentation progressive de la taille des cellules dans les zones centrales et périphériques (Fig. 1D). Fait intéressant, nous avons observé un groupe d'EPR bi-ciliés au cours des stades de développement (Fig. S1). A P0, 1,62 ± 1,44 % des EPR ciliées étaient bi-ciliées en zone périphérique alors que 10,26 ± 5,43 % en zone centrale. A P7, 12,11 ± 3,50 % des EPR ciliées étaient bi-ciliées en zone périphérique alors que 13,58 ± 6,99 % en zone centrale. Les RPE bi-ciliés étaient soit mononucléés, soit binucléés. Pris ensemble, ces résultats ont montré que le moment de la résorption des cils primaires chez les souris CD1 est différent de C57CL6. De plus, le démontage des cils varie dans les zones centrales et périphériques chez les souris CD1. À partir de P0 dans la zone périphérique et de P7 dans la zone centrale, les cils se désassemblent progressivement dans le RPE de ces souris et semblent être presque absents par P21.

Démontage des cils primaires au cours du développement chez la souris albinos RPE. L'assemblage et le démontage des cils primaires sont régulés dynamiquement au cours du développement de l'EPR chez les souris albinos CD1. (A) Images confocales d'échantillons de rétine à montage plat à différents âges postnatals montrant les zones périphériques ou centrales de l'EPR. ZO-1 coloration des jonctions cellulaires (rouge), Arl13b est un marqueur ciliaire (vert), noyaux (bleu). Les grossissements de chaque image correspondante sont affichés. Barres d'échelle : petites 20 μm ; images agrandies 20 μm. Les flèches indiquent les cils. (B) Quantification de la ciliation dans RPE au cours du développement. P0 n = 50 cellules, P7 n = 50 cellules, P14 n = 50 cellules, P21 n = 50 cellules. Nombre d'yeux : 3 ou 4 par point de temps. (C) Quantification de la longueur du cil (D) Quantification de la surface cellulaire. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test t de Student, p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Les souris knock-out BBS4 récapitulent de nombreux phénotypes de ciliopathie humaine, y compris la dégénérescence rétinienne68. Pour déterminer si BBS4 joue un rôle dans la ciliogenèse et la maturation de la RPE et pourrait contribuer à leur dégénérescence rétinienne, nous avons analysé la RPE dans des flatmounts de souris germinales Bbs4-null à P0 et dans des témoins appariés selon l'âge en utilisant la même approche que nous avons pris pour notre CD1 albinos analyse (Fig. 2A). Nos résultats ont montré que les niveaux de ciliation étaient significativement diminués dans le RPE Bbs4-null par rapport aux cellules témoins. Pour la zone centrale, la ciliation des flatmounts RPE chez les souris Bbs4-null était de 53,8 % contre 74,9 % dans le groupe témoin apparié selon l'âge. Pour la zone périphérique, la ciliation des flatmounts RPE chez les souris Bbs4-null était de 51, 2% contre 78, 1% dans le contrôle de type sauvage (Fig. 2B). Conformément aux résultats de la ciliation, la longueur ciliaire était également modérément plus courte dans l'EPR Bbs4-null par rapport aux témoins dans les zones centrale et périphérique (Fig. 2C), bien que les différences ne soient pas statistiquement significatives. La longueur ciliaire moyenne dans les flatmounts RPE était de 1, 3 μm dans la zone centrale des souris Bb4-null et de 1, 6 μm dans le contrôle de type sauvage; 1,2 μm dans la zone périphérique dans le RPE Bbs-null et 1,6 μm dans le contrôle de type sauvage. De plus, il y avait une tendance à l'augmentation de la taille des cellules dans la zone centrale du groupe mutant, alors que la taille des cellules dans la zone périphérique est restée inchangée (Fig. 2D). De plus, le niveau d'expression général de ZO-1 n'a révélé aucune différence significative entre les souris témoins et les souris Bbs4-null.

La perte de BBS4 affecte la ciliation dans l'EPR in vivo. Le knock-out de BBS4 modifie la ciliation RPE in vivo. (A) Images d'immunofluorescence représentatives de montures plates RPE de souris P0 des zones périphériques et centrales des compagnons de litière WT et BBS4-null, marquées avec des anticorps pour les cils primaires et les jonctions cellulaires (Arl13b en vert et ZO-1 en rouge) Barres d'échelle : petit 20 µm; images agrandies 20 μm. Les flèches indiquent les cils. (B) Quantification de la ciliation dans RPE au cours du développement. En moyenne, environ 200 à 300 cellules au centre ou à la périphérie de l'EPR ont été comptées pour chaque groupe d'âge. n = 3 yeux. (C) Quantification de la longueur ciliaire dans RPE au cours du développement. (D) Quantification de la taille des cellules dans RPE au cours du développement. Barres d'échelle : 20 μm. n = 1. Les analyses statistiques en (B)–(D) ont été effectuées à l'aide du test t de Student, où P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Nous avons en outre étudié le profil ciliaire dans le tissu RPE humain adulte. Avant d'effectuer l'immunohistochimie, nous avons utilisé la méthode de compensation iDiSCO, qui rend le tissu intact transparent69. Les résultats ont révélé que l'EPR humain adulte formait des cils primaires, comme le confirmait le marquage ARL13B, et que des cils étaient présents dans presque toutes les cellules de la monocouche (Fig. 3). La longueur moyenne des cils primaires était de 3,2 μm. De plus, nous avons constaté une diminution significative de la ciliation et de la longueur ciliaire de l'EPR chez les patients atteints de DMLA (n = 1) par rapport à l'EPR sain. Ensemble, ces résultats ont montré que l'EPR humain, contrairement à l'homologue murin sans macula, forme des cils primaires chez les adultes, ce qui suggère que les cils jouent des rôles dans l'EPR humain qui persistent après la fin du développement et qu'ils peuvent être défectueux dans des conditions pathologiques humaines, telles que que la dégénérescence maculaire.

Cils primaires défectueux dans l'EPR d'un patient atteint de DMLA. (A) Images confocales colorées pour Arl13b (vert) et ZO-1 (rouge) d'un RPE humain sain et d'un patient AMD. (B) Quantification de la ciliation dans le RPE (4 à 5 images confocales individuelles de 63 × ont été imagées/comptées à partir de la zone périphérique de chaque échantillon de RPE humain. 223 × 223 µm2/image). (C) Quantification de la longueur ciliaire en RPE. Barres d'échelle : 10 μm. n = 1. Les analyses statistiques en (B)–(D) ont été effectuées à l'aide du test t de Student, où p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Pour comprendre si la perte ciliaire peut avoir un impact sur le RPE postnatal in vivo, nous avons généré des souris transgéniques avec une perte postnatale sélective du RPE des cils primaires (souris RPE-cKO). Nous avons combiné un allèle conditionnel (floxé) de la protéine de transport intraflagellaire (Ift88), essentielle à la formation et au maintien des cils, avec un allèle Cre piloté par le promoteur BEST1 pour entraîner la perte de cils spécifique à l'EPR. Le transgène BEST1-Cre entraîne l'expression oculaire de Cre qui commence après la naissance à environ P1070,71. L'expression mosaïque de BEST1-Cre dans le RPE nous a permis d'évaluer simultanément l'impact de la perte de cils sur le RPE et sur les cellules voisines témoins de la rétine. Nous avons effectué un génotypage et examiné l'expression de Cre par immunocoloration sur des supports plats RPE de chaque souris, puis nous nous sommes concentrés sur des souris avec une expression de 90% pour une analyse plus approfondie (Fig. 4A, B). Nous avons observé des défauts pigmentaires inégaux (hypopigmentation régionale) chez des souris RPE-cKO sur des supports plats RPE et à la lampe à fente (Fig. 4C, D, Fig. S3). Pour étudier la maturation de RPE chez des souris RPE-cKO, nous avons comparé l'intensité de fluorescence de RPE65 sur des supports plats RPE chez RPE-cKO et des souris témoins. Nous avons analysé à la fois la zone centrale et la zone périphérique (Fig. 4E – G). Nous avons constaté une diminution significative de l'expression de RPE65 chez les souris RPE-cKO par rapport au groupe témoin. Ensuite, nous avons comparé l'expression à la fois d'ezrin, un marqueur de polarité pour le RPE, et de ZO-1 chez les souris RPE-cKO et témoins, mais nous n'avons trouvé aucune différence (Fig. S2). Pour évaluer la morphologie et la fonction des photorécepteurs chez les souris RPE-cKO, nous avons évalué l'épaisseur de la couche de photorécepteurs par imagerie OCT et la réponse électrique des photorécepteurs par ERG chez des souris âgées de 2 et 6 mois (Fig. 4H – M, Fig. S2) . Ni les réponses ERG scotopique (adaptation à l'obscurité) ni photopique (adaptation à la lumière) n'ont montré de différences significatives d'amplitudes des ondes b ou a entre les souris RPE-cKO et les témoins à l'âge de 2 ou 6 mois. Ces données suggèrent que les RPE sont légèrement compromis, mais pas suffisamment sévèrement pour endommager l'activité des photorécepteurs.

Hypopigmentation et perte de RPE65 lors de la perte conditionnelle de cils chez la souris. Évaluer l'impact de la perte conditionnelle de cils sur l'EPR, la rétine et la fonction visuelle. (A, B) RPE flatmounts colorés avec l'anticorps Cre (rouge) révélant l'expression de Cre dans le groupe RPE-cKO. (C, D) Flatmount RPE de souris RPE-cKO montrant une hypopigmentation régionale dans le RPE périphérique indiqué par une boîte rouge. Barres d'échelle : 300 μm. (E, F) RPE65 coloration (vert) dans les flatmounts RPE dans les groupes knock-out et contrôle à 2 mois. Le graphique montre les niveaux quantitatifs de fluorescence pour la coloration RPE65 au fil du temps. (H – J) Images SD-OCT de témoins et de rétines de souris RPE-cKO de 2 mois à 6 mois. Mesure de l'épaisseur de la couche nucléaire externe (ONL) obtenue à partir des deux points de temps. (K – M) Enregistrements d'électrorétinogramme (ERG) pour RPE-cKO et souris témoins. ERG adapté à l'obscurité montrant la fonction de photorécepteur de la tige. ONL ; couche nucléaire externe, RGL; couche de cellules ganglionnaires rétiniennes, INL ; couche nucléaire interne. n = 3 animaux dans le groupe RPE-cKO de 2 mois ; n = 5 animaux dans le groupe témoin de 2 mois ; n = 5 animaux dans le groupe RPE-cKO de 6 mois ; n = 3 animaux en contrôle de 6 mois. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle, p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Barres d'échelle : 20 μm.

Dans l'endothélium cornéen de souris, les cils primaires se désassemblent à l'âge adulte mais se réassemblent en réponse à la réparation tissulaire induite par une blessure72. Ces résultats nous amènent à émettre l'hypothèse que les cils RPE peuvent également se reformer en réponse à des blessures et des dommages. Nous avons choisi de tester cette idée en utilisant une approche de blessure induite par la photocoagulation au laser qui a été couramment utilisée pour étudier la cicatrisation des plaies RPE in vivo73,74,75. Nous avons effectué une photocoagulation au laser sur des souris transgéniques à double cil et corps basal (Arl13b-mCherry; Centrin2-GFP), ce qui nous permettrait de visualiser directement les cils, les centrioles et les corps basaux in vivo à l'aide de la microscopie à fluorescence76,77,78,79. La couche RPE/choroïde a été récoltée à différents moments après une blessure au laser. Les bordures RPE ont été étiquetées avec ZO-1 et imagées sous forme de montages plats. Nous avons constaté que l'EPR de la souris répondait à la blessure en reformant ses cils sur les cellules migrantes et nouvellement proliférées pendant la cicatrisation de l'EPR et que les cils primaires se résorbaient lorsque la réparation semblait terminée (Fig. 5A). Plus précisément, 1 h après la blessure au laser, les bordures des cellules RPE ont été réduites dans un bord clair du motif de points laser, indiquant une perte de cellules RPE dans cette région. Les RPE adjacents à la zone laser sont restés de forme hexagonale et non ciliés. 48 h après la blessure, les cils primaires (le rapporteur Arl13b-mcherry est apparu adjacent au corps basal centrine-GFP) sont devenus détectables pour la première fois sur les cellules adjacentes élargies et nouvellement proliférantes (cellules de petite taille). 72 h après la blessure, la majeure partie de la zone laser était couverte de cellules et de cellules ciliées supplémentaires. Fait intéressant, quelques RPE ciliés sporadiques ont également été détectés sur des zones non laser à 500 μm du site du laser, ce qui suggère que des cellules RPE supplémentaires répondaient également même si leur morphologie restait inchangée. Les cils primaires étaient à peine détectables au jour 7 après les dommages au laser depuis la fin de la réparation. Les mesures de la ciliation et de la longueur ciliaire au cours du processus de réparation ont été mesurées et ont montré que la ciliation était la plus élevée 72 h après le laser (Fig. 5B, C). Nous avons en outre étudié si l'emplacement du corps basal était lié à la direction migratoire en mesurant la distance entre le corps basal et la médiane cellulaire, comme décrit72. Nos résultats n'ont montré aucune différence significative au cours de la cicatrisation, ce qui indique que les cils RPE ne sont pas impliqués dans le schéma cellulaire en réparation (Fig. 5D). En résumé, nos données ont montré que les cils primaires sont reformés sur les cellules RPE adultes pendant la cicatrisation des plaies, ce qui indique que les cils nouvellement formés peuvent contribuer à la cicatrisation des plaies sur les RPE de souris in vivo.

Réassemblage primaire des cils chez l'adulte RPE pendant la réparation. (A) Images d'immunofluorescence représentatives montrant la zone de plaie des flatmounts RPE 0, 2, 3, 7 jours après la blessure au laser. Zone laser (cercles en pointillés jaunes) avec cils marqués (Arl13b en rouge et Centrin2 en vert) et bordure RPE (blanche) montrée sur les supports plats RPE. À 1 h après le laser, les RPE près de la zone laser restent aciliés. Les cils primaires (cercle rouge) sont détectés sur le RPE migrant et nouvellement proliféré près de la zone laser à 72 h et à peine détectés au jour 8 après le laser. La bordure cellulaire est représentée en blanc coloré avec ZO-1, Arl13b en rouge et Centrin2 en vert. (B, C) Quantification de la ciliation et de la longueur ciliaire (n = 4). (D) Mesure entre l'emplacement du corps basal et le milieu cellulaire. n = 3 animaux par groupe. Barres d'échelle : 20 μm. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de l'ANOVA à une voie, p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Des études antérieures ont montré que la photocoagulation au laser entraîne la prolifération des cellules RPE dans les yeux de souris pendant le processus de cicatrisation73,80,81. Pour étudier l'implication des cils primaires dans cette réparation et cette prolifération des plaies RPE, nous avons utilisé la photocoagulation au laser pour produire une blessure de taille constante afin d'induire la cicatrisation des plaies chez nos souris RPE-cKO conditionnelles et des témoins appariés selon l'âge. Nous avons collecté la couche RPE/choroïde 24 h et 48 h après l'administration du laser et visualisé la morphologie du RPE par coloration à la phalloïdine sur des supports plats. 24 h après le traitement au laser, aucune différence significative dans la taille de la plaie n'a été détectée dans les deux groupes. Étonnamment, la taille de la zone de la plaie a été significativement réduite dans le groupe RPE-cKO par rapport aux témoins, et dans le groupe témoin, le resurfaçage à travers la zone de la plaie est resté incomplet à 48 h (Fig. 6A, B). Dans le groupe RPE-cKO, la guérison était presque complète à ce moment. Par rapport aux groupes témoins appariés selon l'âge, nous avons constaté une réduction significative du taux de réassemblage des cils primaires, sur la base du signal Arl13b, chez les souris RPE-cKO après 48 h de traitement au laser (Fig. S4, 48,70 ± 4,71 % chez les souris appariées selon l'âge). groupes témoins à 8,06 ± 4,95 % chez les souris RPE-cKO). Pour déterminer si les cils défectueux favorisaient la cicatrisation des plaies RPE en régulant l'activité proliférative, nous avons évalué le nombre total de cellules, déterminé par la coloration à la phalloïdine et la coloration des noyaux dans la couche RPE traitée au laser (diamètre en 200 μm). L'analyse a montré une augmentation significative du nombre de cellules dans la zone traitée au laser du groupe de mutants RPE-cKO par rapport aux témoins aux deux moments (Fig. 6C). Des cellules Ki67-positives ont été trouvées dans la couche RPE de la zone traitée au laser et dans la zone adjacente non traitée. Nous avons ensuite évalué le nombre de cellules Ki67-positives dans un diamètre de 500 μm, qui comprend la plupart des cellules proliférantes, et avons trouvé une différence significative entre RPE-cKO et les groupes témoins 24 h après le laser, indiquant que les cils défectueux amélioraient la prolifération cellulaire pendant la cicatrisation. . Des cellules Ki67 positives étaient présentes dans les deux groupes 48 h après le laser. Pris ensemble, ces résultats ont démontré que les cils défectueux favorisent la cicatrisation des plaies chez la souris RPE.

Les cils défectueux favorisent la cicatrisation des plaies RPE en contrôlant la prolifération. (A) Analyse par immunofluorescence de la phalloïdine (rouge) et de l'anticorps Ki67 (jaune) dans les flatmounts RPE de RPE-cKO et de souris témoins à 24 h et 48 h après le traitement au laser. Des flatmounts RPE ont été préparés à partir de souris RPE-cKO adultes et de souris témoins 24 h et 48 h après la photocoagulation au laser (24 h : n = 6 et 10 yeux ; 48 h : n = 4 et 8 yeux) et colorés avec Ki67 (marqueur cellulaire prolifératif ) et la phalloïdine (bordure cellulaire). (B) Quantification de la taille de la plaie dans les groupes RPE-cKO et témoins basés sur la coloration à la phalloïdine, qui a été analysée par ImageJ avec correction manuelle (en aveugle aux groupes d'échantillons lors de l'analyse). (C) Quantification du nombre de cellules dans la zone laser (200 μm). (D) Quantification du nombre de cellules Ki67-positives à moins de 500 μm. Barres d'échelle : 20 μm. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test t de Student, p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Nous décrivons ici un nouveau rôle des cils primaires dans la réparation des plaies de RPE de souris adulte. Nous avons d'abord confirmé la rétraction primaire des cils sur différentes lignées de souris à partir de rapports précédents et démontré que BBS4 contribue à la ciliation. Ces données étendent les découvertes précédentes pour les cils RPE au cours du développement63,64. Nous avons également constaté que les cils primaires persistent sur l'EPR à l'âge adulte chez l'homme, ce qui suggère qu'ils continuent à contribuer aux fonctions cellulaires après la maturation. De plus, nous avons montré que les cils primaires sont réassemblés après une blessure, qu'ils persistent pendant le processus de réparation et que la déplétion conditionnelle d'Ift88 à partir de l'EPR influence la prolifération, ce qui favorise la cicatrisation.

Seules quelques études se sont concentrées sur la compréhension de la morphologie et de la fonction des cils primaires sur RPE in vivo qui ont été ignorées pendant des décennies. On sait que les cils primaires sont essentiels à la maturation de l'EPR chez la souris et agissent en régulant la signalisation canonique Wnt63. Les cils primaires de RPE sont également connus pour être résorbés après la maturation, qui dépend des protéines BBSome et de la signalisation canonique-Wnt64, bien que des rapports contradictoires suggèrent que les cils des RPE de souris sont conservés tout au long de l'âge adulte82. La présente étude a révélé que les niveaux de cils primaires chez les souris albinos diminuent également avec l'augmentation des stades de développement, ce qui appuie les rapports de Patnaik et al.64. De plus, nous avons constaté que le temps de rétraction des cils était retardé chez les souris albinos par rapport aux souris pigmentées C57BL/6. Cela nous a suggéré que, peut-être, dans une rétine albinos sujette à des processus de blessure potentiels induits par la lumière, des cils peuvent rester et être impliqués dans un processus de réparation potentiel difficilement observable dans une rétine de souris pigmentée. Une étude antérieure des cils sur des rats albinos a également découvert des cils primaires au stade postnatal65. Il a été démontré que la ciliogenèse contrôle négativement la mélanogenèse dans les mélanocytes83. Alternativement, les différences de temps de rétraction peuvent être dues à des différences de souche ou directement liées à la synthèse de mélanine. BBS6 et BBS8 ont été démontrés comme étant impliqués dans le désassemblage des cils et la maturation de l'EPR chez la souris au cours du développement64. Plus précisément, le RPE déficient en BBS8 présentait des défauts phénotypiques et affectait l'homéostasie du RPE84. Ici, nous avons montré un rôle important de BBS4 dans la ciliogenèse RPE au cours du développement. Fait intéressant, des rapports antérieurs indiquent que l'absence de BBS8 ou BBS6 a altéré à la fois la ciliation et la longueur ciliaire chez la souris RPE. Nous n'avons trouvé aucun changement dans la longueur ciliaire dans le RPE knock-out BBS4. De plus, nous avons constaté que les RPE humains conservent des niveaux de ciliation stables à l'âge adulte. Les différences dans les profils de ciliation sont donc susceptibles d'être causées par des différences spécifiques à l'espèce dans la régulation primaire des cils. Fait intéressant, nous avons constaté que les cellules RPE humaines conservent des niveaux de ciliation stables à l'âge adulte. Les différences dans les profils de ciliation sont probablement causées par des différences spécifiques à l'espèce dans la régulation primaire des cils. Les cils primaires dans l'EPR de souris peuvent être cruciaux dans ce tissu et d'autres cellules oculaires dans le développement rétinien, mais indispensables pour la fonction cellulaire dans l'EPR adulte car les souris ne possèdent pas de macula. En revanche, les cils primaires semblent être essentiels dans l'EPR des humains adultes et altérés dans les maladies rétiniennes. Par conséquent, les souris ne sont pas susceptibles de fournir des modèles optimaux pour l'étude des ciliopathies oculaires.

Au cours du processus de réparation de la plaie, les cellules épithéliales qui entourent la lésion prolifèrent et migrent pour refaire la surface de la plaie60,85. Les cils primaires sont supposés subir des altérations majeures pendant la cicatrisation58,60,86, et le processus d'assemblage/démontage des cils est considéré comme profondément impliqué dans la réponse à la blessure. Dans les cellules endothéliales cornéennes, les cils primaires se reforment rapidement au stade précoce de la réponse tissulaire à une blessure mécanique, naviguant dans la morphogenèse cellulaire et la structuration72. Une fois la cicatrisation terminée et la morphogenèse stable, les cils primaires sont réabsorbés. Dans les cellules ciliées de l'oreille interne, par exemple, les cils adultes repoussent après un traumatisme87. Dans les cellules tubulaires rénales, la longueur des cils primaires augmente au cours de la réparation rénale88. Nos données actuelles ont montré que les cils sont rapidement réassemblés chez la souris RPE se produit rapidement pendant la cicatrisation induite par laser, puis démontés lorsque le processus de réparation est terminé.

Des études antérieures ont montré que les cils primaires influencent passivement la prolifération cellulaire et le cycle cellulaire62,89. Les cils se désassemblent lorsque les cellules réintègrent le cycle cellulaire et se rassemblent à la phase G1/G0 du cycle cellulaire. Il n'est pas surprenant que les cils primaires régulent négativement la prolifération de l'EPR pendant la réparation. Nous avons constaté que l'épuisement de l'Ift88 pour l'EPR postnatale favorise le taux de réparation des plaies en améliorant la prolifération cellulaire. Le mécanisme sous-jacent doit être étudié plus avant, mais la voie ß-caténine/Wnt pourrait être au moins en partie responsable, puisqu'il a été rapporté qu'elle est induite par la photocoagulation au laser in vivo73.

Dans l'étude de développement de RPE, l'une des limitations techniques consistait à utiliser un seul marqueur ciliaire, Arl13b, pour visualiser les cils primaires dans les tissus RPE de souris et humains. Cette limite peut expliquer en partie les différences de rapprochement entre nos données et celles d'autres publications64. De plus, nous avons utilisé un pilote Cre RPE à maturité tardive, BEST1, pour supprimer génétiquement Ift88 du RPE de souris. Étant donné que l'expression du promoteur BEST1 se produit tardivement, l'élimination des cils peut avoir un impact limité sur la maturation et l'homéostasie de l'EPR.

En conclusion, cette étude donne un aperçu du rôle des cils primaires dans l'EPR adulte in vivo. Nous avons montré que les cils primaires se reforment rapidement pendant la réparation de l'EPR, ce qui régule négativement la cicatrisation des plaies en inhibant la prolifération, fournissant ainsi une cible thérapeutique potentielle dans les maladies dégénératives de l'EPR. Nous avons également montré que l'EPR humain continue d'exprimer les cils primaires à l'âge adulte. Ensemble, ces résultats améliorent la compréhension du rôle joué par les cils primaires dans la pathogenèse de la réparation défectueuse des plaies RPE.

Les anticorps primaires, la source, le numéro de catalogue et les dilutions sont les suivants : souris anti-Arl13b (Antibodies Incorporated, N295B/66, 1:2000) ; lapin anti-zonula occludens-1 (ZO-1) (Invitrogen, 617300, 1:350); souris anti-Cre (Millipore, clone 2D8, 1:400); souris anti-RPE65 (Abcam, ab13826, 1:500); souris anti-Ezrin (Millipore, E8897, 1:500); souris anti-Ki67 (Cell Signaling, 9449 T, 1:500); rhodamine phalloïdine (Invitrogen, R415, 1:1000). Anticorps secondaires : AlexaFluor 488, 647 et 594 IgG (Life Technologies, 1:200). ProLong Gold Antifade Mount et DAPI d'Invitrogen.

Les souris CD-1 IGS ont été obtenues auprès de Charles River Laboratory. L'Arl13b-mCherry ; Des souris Centrin2-GFP ont été achetées auprès du Jackson Laboratory (appelées souris Arl, stock n° 027967). Cette double souche transgénique exprime la fluorescence mCherry et GFP pour marquer respectivement la protéine ciliaire (Arl13b) et la protéine des corps basaux (Centrin2). Une souris knock-out Ift88 spécifique à RPE a été générée en croisant les souris Ift88 floxées (stock n° 022409 du Jackson Laboratory) avec des souris transgéniques BEST1-Cre71. La PCR pour le génotypage de la souris a été réalisée en utilisant l'ADN génomique de la biopsie de la queue comme décrit90. Les amorces étaient : BEST1-Cre, Forward : TCCGAAAAGAAAACGTTGATG ; Revers : CCCGGCAAAACAGGTAGTTA ; Des animaux hétérozygotes ont été utilisés comme témoins de type sauvage. Les animaux ont été logés sous un cycle lumière/obscurité de 12 h avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Les souris ont été adaptées à l'obscurité pendant la nuit et euthanasiées sous une faible lumière rouge par inhalation de CO2. Les yeux ont été énucléés et disséqués dans du PBS froid, suivis d'une fixation dans du paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparé pendant 1 h à température ambiante.

Les yeux de souris mutantes BBS4 et les témoins ont été obtenus auprès du Dr Nicolas Berbari (Université de l'Indiana). Les yeux BBS4 ont été récoltés à partir de chiots mutants et témoins de type sauvage le jour de la naissance (P0), fixés dans du paraformaldéhyde à 4% pendant une nuit à 4 ° C, puis expédiés dans du PBS froid.

Les souris ont été anesthésiées par un mélange de xylazine (0,01 mg/g) et de kétamine (0,08 mg/g), suivi d'une dilatation de la pupille avec du tropicamide (Akorn, Somerset, New Jersey) et de la phényléphrine. Un laser PASCAL de 577 nm (Topcon Medical Laser System, Inc., Santa Clara, CA) assisté par un système de lampe à fente a été utilisé pour induire des lésions laser uniques dans les yeux de souris91. Les paramètres du laser étaient les suivants : puissance typique de 70 mW, durée de 20 ms, diamètre du spot aérien de 200 μm. 6 spots laser ont été uniformément répartis sur la rétine de la souris à au moins 1 mm de distance de chaque spot. L'énergie laser est absorbée par la pigmentation dans les cellules RPE et émise sous forme de chaleur vers la rétine, entraînant à la fois la RPE et la mort des cellules photoréceptrices. Le succès du traitement est déterminé par un blanchiment rétinien immédiatement visible et une fuite sur l'angiographie à la fluorescéine.

Les pupilles de la souris ont été dilatées par le tropicamide et la phényléphrine 10 min avant l'administration de l'anesthésie comme décrit92. Les souris ont été adaptées à l'obscurité pendant 12 h avant l'enregistrement ERG. L'enregistrement ERG a été effectué avec un stimulateur Celeris ERG (Diagnosys LLC) sous une faible lumière rouge conformément aux instructions. En bref, les souris ont été placées sur un coussin chauffant et des larmes artificielles ont été appliquées sur la surface cornéenne pour prévenir la sécheresse. Deux électrodes ERG ont été doucement placées sur la surface cornéenne et la stimulation lumineuse a été contrôlée par le logiciel Espion comme décrit (version 6 ; Diagnosys)70. Quatre souris par groupe et 300 lectures par œil ont été enregistrées. Trois répétitions ont été réalisées dans l'étude.

L'imagerie OCT a été réalisée immédiatement après l'enregistrement ERG. Une lentille de contact (Advanced Vision Technologies) a été placée sur la cornée de la souris avant d'appliquer des larmes artificielles pour maintenir l'humidité de la cornée comme décrit92. Les images OCT ont été acquises à l'aide du système Heidelberg Spectralis SLO/OCT (Heidelberg Engineering, Allemagne). Les scans de la rétine ont été obtenus et alignés avec des images centrées autour de la tête du nerf optique. L'épaisseur de la couche de photorécepteur a été mesurée par masquage en double aveugle des échantillons et moyennée par le logiciel Heidelberg. La moyenne de l'épaisseur des photorécepteurs chez les souris RPE-cKO a été comparée à des souris hétérozygotes comme témoin.

Pour les expériences RPE flatmount, les souris ont été adaptées à l'obscurité pendant 6 h avant que leurs yeux ne soient énucléés. Le tissu rétinien et le segment antérieur (cornée, iris et corps ciliaire et cristallin) ont été immédiatement retirés dans du PBS froid sous une faible lumière rouge. Les couches RPE/choroïde ont ensuite été immergées dans une fixation PFA à 4 % pendant 1 h à température ambiante. Les tissus fixés ont été lavés avec du PBS 3 fois et incubés pendant 1 h dans un tampon de blocage contenant 10 % de sérum de chèvre, 0,3 % de Triton X-100 à température ambiante. Après blocage, les couches RPE/choroïde ont été incubées avec des anticorps primaires à 4 ° C pendant la nuit. Après les lavages dans du PBS, les tissus ont été incubés dans le tampon de blocage contenant des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. Les noyaux ont été colorés avec la coloration nucléaire DAPI 405. Huit coupes radiales ont été faites du bord de l'œilleton à l'équateur avant d'être montées avec ProLong Gold (Life Technologies) sur des lamelles. L'imagerie confocale a été réalisée avec un microscope confocal Zeiss LSM880.

Des échantillons de tissus anonymisés d'un œil de donneur de dégénérescence maculaire humaine et liée à l'âge en bonne santé ont été obtenus auprès du département de pathologie de l'Université de Stanford, à Palo Alto, en Californie. L'œil a été obtenu dans les 48 h suivant le décès et stocké dans une chambre humide à 4 ° C après l'énucléation. La cornée, l'iris, le cristallin et le corps vitré ont été retirés par une incision coronale pratiquée à 3 mm en arrière du limbe. Les globes ont été fixés dans du PFA à 4 % pendant une nuit et lavés dans du PBS 1 × à 4 °C. L'œil provenait d'un patient ne présentant aucune pathologie du segment postérieur. Une couche de RPE d'environ 6 à 8 mm2 a été dissociée de la rétine et de la choroïde avant d'être aplatie à l'aide de la technique de micro-dissection.

Le tissu RPE humain fixé a été lavé dans du PBS pendant 1 h, puis dans du méthanol à 50 % (dans du PBS) pendant 1 h, du méthanol à 80 % pendant 1 h et du méthanol à 100 % pendant 1 h deux fois. Les échantillons ont ensuite été blanchis avec 5 % de H2O2 dans 20 % de DMSO/méthanol à 4 °C pendant une nuit. Après le blanchiment, les échantillons ont été lavés dans du méthanol pendant 1 h, puis dans du DMSO/méthanol à 20 % pendant 1 h deux fois, puis dans du méthanol à 80 % pendant 1 h, du méthanol à 50 % pendant 1 h, du PBS pendant 1 h deux fois, et enfin dans du PBS /0,2 % Triton X-100 pendant 1 h deux fois avant d'autres procédures de coloration69.

Un cil primaire a été compté sur la base du signal Arl13b dans les Fig. 1 et 2 : pour distinguer du bruit de fond non spécifique, un signal Arl13b-positif continu avec une structure linéaire claire a été compté comme un cil primaire. Plus précisément, les flatmounts RPE ont été capturés à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 880 à 63 × avec un zoom optique de 0,6 × (223 × 223 μm2). Les images ont été capturées avec Z-stack (intervalle de 0,3 μm) pour une meilleure caractérisation des cils primaires à partir d'une coloration non spécifique. Sur la Fig. 5, les cils primaires ont été déterminés par deux marqueurs ciliaires primaires (signal Arl13b et centrin2).

Pour la mesure de la taille de la plaie, nous avons analysé la réépithélialisation sur des montages plats RPE au laser de RPE-cKO et de souris témoins 24 h et 48 h après le traitement au laser (en aveugle aux groupes d'échantillons). À cette fin, nous avons utilisé un anticorps anti ZO-1 ou de la phalloïdine pour visualiser les bordures cellulaires. La taille de la zone non épithélialisée a été mesurée par le logiciel FIJI ImageJ (National Institutes of Health Bethesda, MD, USA) avec assistance manuelle. La quantification de l'intensité de fluorescence pour la coloration RPE-65 et ezrin a été calculée en faisant la moyenne de l'intensité des pixels à l'aide du logiciel Zeiss conformément aux directives recommandées.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel Graphpad8 (Prism). Les résultats sont exprimés en valeurs moyennes ± SEM. L'analyse statistique a été traitée par un test t non apparié pour la comparaison de deux groupes. Les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été déterminées comme statistiquement significatives.

Nos travaux sur des échantillons humains ont été menés conformément aux principes de la Déclaration d'Helsinki pour la recherche médicale impliquant des sujets humains. L'étude a été approuvée par l'Institutional Review Board (IRB) de l'Université de Stanford. Cette étude est rapportée conformément aux directives ARRIVE. Au préalable, un consentement éclairé écrit signé a été reçu des représentants légaux autorisés pour l'utilisation d'échantillons à des fins de recherche. Toutes les procédures liées aux animaux étaient conformes aux directives de l'Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research, et toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de École de médecine de l'Université de Stanford. Toutes les procédures pour les souris BBS4 ont été approuvées par l'IACUC de l'Indiana University-Purdue University Indianapolis.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions le Dr Daniel Palanker pour ses précieux conseils et son soutien ; le Dr Ruwan A. Silva pour avoir fourni des tissus RPE humains ; Dr Philip P. Prosseda, Dr Xiaowan Ma, Dr Biao Wang et Dr Qing Wang pour leurs contributions techniques.

Ce travail a été soutenu par NIH/NEI K08-EY022058 (YS), R01-EY025295 (YS), R01-EY032159 (YS), R01-EY-023295 (YH) R01-EY024932 (YH), ​​R01-EY025790 (DV) , R01-DK114008 (ONF). VA mérite CX001298 (YS), Ziegler Foundation for the Blind (YS), Showalter Foundation (YS), Children's Health Research Institute Award (YS). Recherche pour la prévention de la cécité Subvention sans restriction (Stanford Ophthalmology), American Glaucoma Society (YS), Lowe Syndrome Association (YS) et Knights Templar Eye Foundation (YS). Subvention P30 Vision Center au département d'ophtalmologie de Stanford (P30EY026877). YS est une boursière de la faculté Laurie Kraus Lacob en médecine translationnelle pédiatrique. Ce travail a également été soutenu par NIH/NEI K99-EY34932 (KN), International Retinal Research Foundation (KN), BrightFocus Foundation (KN) et ARVO travel Grant (KN).

Département d'ophtalmologie, École de médecine de l'Université de Stanford, 1651 Page Mill Road, Rm 2220, Palo Alto, CA, 94304, États-Unis

Ke Ning, Mohajeet B. Bhuckory, Chien-Hui Lo, Brent E. Sendayen, Tia J. Kowal, Ming Chen, Douglas Vollrath, Vinit B. Mahajan, Yang Hu et Yang Sun

Administration des anciens combattants de Palo Alto, Palo Alto, Californie, États-Unis

Brent E. Sendayen et Yang Sun

Département de génétique, École de médecine de l'Université de Stanford, Palo Alto, Californie, États-Unis

Douglas Vollrath

Département de biologie, Indiana University-Purdue University Indianapolis, Indianapolis, IN, États-Unis

Ruchi Bansal & Nicolas F. Berbari

Département d'ophtalmologie, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis

Kun Che Chang

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KN, YS ont conçu et réalisé toutes les expériences et rédigé le manuscrit. MB a contribué au traitement au laser et à l'édition du manuscrit. BS a contribué à générer des lignées de souris. TK, CHL et MC ont contribué à l'analyse des données de conception expérimentale. RS a fourni des yeux de souris BBS4-null et a aidé à l'analyse. DV, NFB, KCC, VM et YH ont fourni de précieux conseils et suggestions expérimentales pour cette étude. YS a supervisé l'ensemble du projet.

Correspondance avec Yang Sun.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ning, K., Bhuckory, MB, Lo, CH. et coll. Réparation des plaies associées aux cils médiée par IFT88 dans l'épithélium pigmentaire rétinien. Sci Rep 13, 8205 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35099-3

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Reçu : 06 décembre 2022

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 21 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35099-3

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