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Sep 08, 2023

Activité antibactérienne de vB

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7470 (2023) Citer cet article

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Les enzymes lytiques des phages sont des agents antimicrobiens prometteurs. Dans cette étude, une endolysine dérivée de vB_AbaM_PhT2 (vPhT2), a été identifiée. Cette endolysine représentait le domaine lysozyme conservé. L'endolysine recombinante (lysAB-vT2) et l'endolysine de fusion hydrophobe (lysAB-vT2-fusion) ont été exprimées et purifiées. Les deux endolysines ont montré une activité lytique contre la paroi cellulaire brute bactérienne des bactéries Gram-négatives. La CMI de la fusion lysAB-vT2 était de 2 mg/ml correspondant à 100 µM, tandis que la CMI de lysAB-vT2 était supérieure à 10 mg/ml (400 µM). La combinaison de la fusion lysAB-vT2 avec la colistine, la polymyxine B ou le cuivre était synergique contre A. baumannii (valeur FICI de 0,25). L'activité antibactérienne de la fusion lysAB-vT2 plus colistine aux concentrations inhibitrices fractionnaires (FIC) a révélé qu'elle peut inhiber Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et diverses souches d'A. baumannii extrêmement résistant aux médicaments (XDRAB) et d'A. baumannii résistant aux phages. La fusion lysAB-vT2 a conservé son activité antibactérienne après incubation de l'enzyme à 4, 20, 40 et 60 °C pendant 30 min. La fusion lysAB-vT2 pourrait inhiber le biofilm mature, et l'incubation de la fusion lysAB-vT2 avec des cellules humaines T24 infectées par A. baumannii a conduit à une réduction partielle de la libération de LDH par les cellules T24. En résumé, notre étude met en évidence la capacité antimicrobienne de l'endolysine de fusion lysAB-vT2, qui peut être appliquée pour le contrôle de l'infection à A. baumannii.

Acinetobacter baumannii est une bactérie Gram-négative émergente comme une cause majeure d'infection nosocomiale et est particulièrement problématique pour les patients sous assistance respiratoire avec des séjours hospitaliers de longue durée. Les associations avec une incidence croissante d'A. baumannii panrésistants aux médicaments, qui résistent au traitement antibiotique de dernier recours colistine, ont alimenté la recherche de nouveaux agents antimicrobiens. Un candidat potentiel est la phagothérapie, qui utilise des bactériophages lytiques ou des enzymes phagiques pour traiter les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques1,2. Cependant, il existe des limites à l'utilisation de virions de phage, y compris la spécificité des phages pour une gamme d'hôtes étroite et le potentiel de développement de résistance3. Notre étude précédente a montré que 50 % des isolats d'A. baumannii en Thaïlande étaient des souches résistantes aux phages contre 17 phages lytiques d'A. baumannii testés4. Ainsi, il existe un intérêt croissant pour l'utilisation d'enzymes lytiques de bactériophages, ou endolysines, en tant qu'agents antimicrobiens par rapport à l'utilisation de virions de phage. Les endolysines sont des enzymes phages qui fonctionnent en hydrolysant la couche de peptidoglycane, entraînant une chute soudaine de la pression de turgescence et une lyse osmotique, qui provoque la mort des cellules bactériennes5. Des endolysines recombinantes de divers phages A. baumannii ont été clonées, exprimées et caractérisées6,7,8,9,10,11,12,13,14. Yuan et al. et Kim et al. ont montré que les endolysines, Abtn-4 et LysSS, présentaient une large activité antimicrobienne contre plusieurs bactéries Gram-positives et Gram-négatives. De plus, les endolysines LysAB3, Abtn-4 et Abp013 se sont révélées efficaces pour réduire le biofilm d'A. baumannii9,13,14. L'activité des endolysines telles que LysABP-01, ABgp46, LysMK34 et ElyA1 peut être améliorée en les combinant avec des perméabilisants de la membrane externe, tels que les acides organiques7 et la colistine8,10,11. De plus, il a été démontré que les endolysines modifiées ont une activité antibactérienne améliorée contre les souches d'A. baumannii résistantes à la colistine15.

Dans une étude précédente, nous avons identifié vB_AbaM_PhT2 qui a montré la meilleure efficacité contre son hôte et diverses souches d'A. baumannii. Ce bactériophage a également montré une synergie avec la colistine16. Une analyse génomique de vB_AbaM_PhT2 a été réalisée à l'aide du séquençage de nouvelle génération (NGS) et a permis l'identification de gènes putatifs codant pour la lysine. Ces enzymes hydrolysent le peptidoglycane dans les parois cellulaires bactériennes et sont donc de bons candidats comme alternatives aux antibiotiques. Bien que de nombreuses endolysines chez A. baumannii aient été caractérisées, il existe moins d'études sur le rôle de l'endolysine de fusion d'acides aminés hydrophobes. La capacité de lyse de l'endolysine d'E. coli a été améliorée par l'ajout d'un acide aminé hydrophobe à l'extrémité C-terminale de l'endolysine17. Par conséquent, nous avons cherché à étudier l'activité antimicrobienne des endolysines de phages recombinants et des endolysines de fusion hydrophobes et leur synergie potentielle avec des antibiotiques, des désinfectants, des métaux lourds et des phages. Les endolysines de fusion ont montré une activité lytique élevée par rapport à l'enzyme native. Les tests de cytotoxicité, l'inhibition de la formation de biofilm et l'activité antimicrobienne contre diverses souches d'isolats d'A. baumannii provenant de divers hôpitaux thaïlandais d'endolysines de fusion ont été étudiés.

Nous avons étudié le génome du phage vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) pour identifier le gène de l'endolysine. L'endolysine a été détectée (QHJ75684.1) dans le génome du phage vPhT2. Le lysAB-vT2 contient 187 résidus d'acides aminés, tandis que la fusion lysAB-vT2 contient 199 résidus d'acides aminés (Fig. 1A). Un domaine conservé par le lysozyme a été détecté à partir des acides aminés 65 à 180 (Fig. 1A). La séquence du gène de l'endolysine vPhT2 donne une identité de séquence de 53, 53 à 60, 54% avec le gène de l'endolysine du phage RL_2015 (n ° d'accès AJG41873.1) et du phage AM24 (n ° d'accès APD20282.1) (Fig. 1B). La comparaison de la séquence d'acides aminés de lysAB-vT2 avec l'endolysine du phage RL_2015 et du phage AM24 a été présentée sur la figure 1C.

Caractérisation et analyse bioinformatique de l'endolysine LysVTh2 (lysAB-vT2). (A) Diagramme schématique du domaine conservé de l'endolysine putative (LysVTh2, lysAB-vT2) et fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion). Ce diagramme a été prédit à l'aide du serveur Web Pfam. (B) Arbre de consensus Bootstrap montrant la relation phylogénétique entre LysVTh2 (lysAB-vT2) et précédemment rapporté 16 des lysines d'A. baumannii. L'histoire évolutive a été déduite à l'aide de la méthode Neighbor-Joining avec 1 000 réplications bootstrap et a été menée dans MEGA 11. (C) Analyse comparative de vB_AbaM_PhT2 (LysVTh2, lysAB-vT2), AM24 (n° d'accès APD20282.1) et RL-2015 (n° d'accès AJG41873.1) endolysines en utilisant la comparaison de séquences multiples par l'algorithme Clustal Omega.

La fusion lysAB-vT2 et lysAB-vT2 a été exprimée sous forme soluble. Les deux rendements en protéines recombinantes purifiées étaient de 5,16 et 4,44 mg par litre de culture. Les protéines purifiées ont été examinées par SDS-PAGE et des bandes d'environ 25 kDa ont été observées, ce qui correspond à la masse moléculaire prédite de 25 kDa (Fig. 2).

Analyse de l'expression protéique et test de lyse sur plaque d'endolysine (LysVTh2, lysAB-vT2) et fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion). Analyse SDS-PAGE pour l'expression et la purification de (LysVTh2, lysAB-vT2) et fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion). Piste M, échelle de protéines précolorées au BLUeye ; Pistes 1, lysat bactérien non induit; Piste 2, lysat bactérien induit par IPTG; Piste 3, l'endolysine purifiée (LysVTh2, lysAB-vT2) et fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) après dialyse.

La protéine recombinante a été utilisée dans un essai sur plaque pour déterminer l'activité lytique des deux endolysines contre les cellules bactériennes brutes. Les résultats ont montré que les deux protéines avaient une activité lytique vis-à-vis des souches A. baumannii ATCC 19606, MDRAB et XDRAB (Fig. 3). Ils ont également une activité lytique contre d'autres cellules brutes Gram-négatives, telles que E. coli, P. aeruginosa et K. pneumoniae (Fig. 3). Cependant, l'activité lytique n'a pas été détectée dans la souche gram-positive S. aureus. La zone d'inhibition de la fusion purifiée - LysVTh2 était plus grande que la LysVTh2 purifiée et le lysozyme de blanc d'œuf (tableau S1).

Essai de lyse sur plaque de l'endolysine purifiée (LysVTh2, lysAB-vT2) et fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) contre A. baumannii. Le test de lyse sur plaque de l'endolysine purifiée (LysVTh2, lysAB-vT2) et fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion) contre A. baumannii a été réalisé en utilisant des cellules autoclavées de A. baumannii ATCC 19606, A. baumannii AB003 (MDRAB), A. baumannii AB329 (XDRAB), Ps. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 27736 et S. aureus ATCC 6538. Le lysozyme de blanc d'œuf (EWL) a été utilisé comme contrôle positif.

Nous avons comparé l'efficacité de deux endolysines recombinantes en déterminant la CMI. La CMI de la fusion lysAB-vT2 ou lysAB-vT2 purifiée a été testée à l'aide de tests d'inhibition de la croissance bactérienne pour sa capacité à inhiber la croissance de cellules viables d'A. baumannii ATCC 19606. Les résultats ont indiqué que la CMI de la fusion lysAB-vT2 était 2 mg/ml correspondant à 100 µM, tandis que la CMI de lysAB-vT2 était supérieure à 10 mg/ml (400 µM).

Nous avons évalué l'effet de la fusion lysAB-vT2 associée à des antibiotiques, des désinfectants, des métaux lourds et le bactériophage vPhT2. Les CMI de tous les agents testés sont présentés dans le tableau S2. L'effet synergique de la fusion lysAB-vT2 a été criblé par un test d'inhibition de la croissance à 0,25 × la CMI de deux agents. Comme le montre la figure 4A, la combinaison des endolysines plus la colistine et la polymyxine B a présenté une activité antibactérienne élevée suivie de CuCl2 avec un pourcentage d'inhibition de 95, 8, 73, 1 et 31, 5%, respectivement (tableau S3). Une faible interaction avec l'EDTA (16,3 %), le ZnCl2 (7,4 %), le composé d'ammonium quaternaire (7,3 %) et l'imipénem (5,9 %) avec la fusion lysAB-vT2 a été observée (tableau S3). Il n'y a eu aucune interaction lors de la combinaison de la fusion lysAB-vT2 avec le chloroxylénol, l'hypochlorite de sodium et le bactériophage vPhT2. Nous avons effectué un test en damier pour mesurer la synergie antibiotique de la colistine, de la polymyxine B et du CuCl2. Les concentrations inhibitrices fractionnaires (FIC) pour la combinaison de lysAB-vT2-fusion avec la colistine étaient de 9,76 et 0,5 ug/ml, la polymyxine B était de 11,71 et 0,5 ug/ml, et CuCl2 était de 10,15 ug/ml et 1,62 mM (Fig. 4B ). Les indices FIC de la fusion lysAB-vT2 et des trois agents ont été calculés à 0, 25, ce qui indique une synergie (Fig. 4B).

Dépistage et tests de confirmation pour l'interaction synergique et la mesure de la synergie par analyse en damier. (A) Le taux d'inhibition de la croissance (le graphique à barres) de lysAB-vT2-fusion avec trois antibiotiques (imipénème, colistine et polymyxine B), trois désinfectants (composé d'ammonium quaternaire, chloroxylénol, hypochlorite de sodium), deux métaux lourds (ZnCl2, CuCl2 ), et le bactériophage vPhT2. Les données sont exprimées en pourcentage moyen ± SD d'expériences en triple. (B) Dosage en damier de lysAB-vT2-fusion avec colistine, CuCl2 et polymyxine B.

Pour évaluer la puissance antimicrobienne de la fusion lysAB-vT2, l'activité antibactérienne de la fusion lysAB-vT2 seule et de la fusion lysAB-vT2 en association avec la colistine a été déterminée contre diverses souches d'A. baumannii et d'autres espèces bactériennes (tableau S4). Parmi les 27 souches d'A. baumannii testées, 14 souches ont été inhibées avec 2 mg/ml d'enzyme avec un pourcentage d'inhibition supérieur à 85 % (Fig. 4B et Tableau S5). Nous avons constaté une activité antibactérienne accrue de la fusion lysAB-vT2 plus colistine, qui peut inhiber E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 27736, les souches A. baumannii MDRAB, XDRAB et NR résistantes aux phages. De plus, en combinaison avec la colistine, l'enzyme peut inhiber la croissance de 22 des 26 souches d'A. baumannii avec plus de 90 % d'inhibition (tableau S6). L'enzyme seule ou l'enzyme avec colistine a présenté une faible inhibition de A. baumannii résistant à la colistine (Fig. 5).

Activité antibactérienne de la fusion lysAB-vT2 et de la fusion lysAB-vT2 plus colistine, polymycine B et CuCl2. Activité antibactérienne de lysAB- vT2-fusion (2 mg/ml) (barre noire), lysAB- vT2-fusion plus colistine (10 ug/ml + 0,5 ug/ml) (barre verte), lysAB- vT2-fusion plus polymyxine B (10 ug/ml + 0,5 ug/ml) (barre bleue) et la fusion lysAB-vT2 plus CuCl2 (10 ug/ml/1,62 mM) (barre rouge) a été déterminée à l'aide d'un test d'inhibition contre E. coli, P. aeruginosa , K.pneumoniae et diverses souches d'A. baumannii.

Un test de stabilité thermique a été exécuté pour analyser la résistance à la chaleur de l'activité antibactérienne de la fusion lysAB-vT2. Nos données ont montré que la fusion lysAB-vT2 conservait une activité antibactérienne avec un pourcentage d'inhibition de près de 95 % après incubation à 20 °C. Les résultats de la fusion lysAB-vT2 après incubation de l'enzyme à 4, 20, 40 et 60 °C ont montré ce pourcentage d'inhibitions à près de 75 %. À 80 °C, le pourcentage d'inhibition de la fusion lysAB-vT2 a chuté à 30 % (Fig. 6). Le pourcentage de réduction de la concentration en protéines était faible à 4, 20 et 40 °C. Nous avons constaté que le pourcentage de réduction de la concentration en protéines était réduit à 80 % à 80 °C (Fig. 6).

Stabilité thermique de la fusion lysAB-vT2. Une stabilité thermique de l'activité antibactérienne de la fusion lysAB-vT2 a été déterminée en utilisant un test d'inhibition bactérienne avec 2 mg/ml de fusion lysAB-vT2 après incubation à 4, 20, 40, 60 et 80 °C pendant 20 min. La barre noire représentait le pourcentage d'inhibition de l'enzyme après traitement thermique et la barre grise représentait le pourcentage de réduction de la concentration en protéines.

La destruction du biofilm bactérien et la cytotoxicité de la fusion lysAB-vT2 ont été déterminées pour évaluer les utilisations possibles de la fusion lysAB-vT2. Le test de biofilm a montré que lors de l'exposition de 4 mg/ml de fusion lysAB-vT2 et de 1 × 108 PFU/ml de phage vPhT2 avec des biofilms A. baumannii de 72 h, nous avons constaté une réduction significative des UFC restant dans les biofilms. Des concentrations enzymatiques inférieures à 4 mg/ml ont augmenté la formation de biofilm (Fig. 7A).

Biofilm et cytotoxicité de la fusion lysAB-vT2. (A) Le test MBEC a quantifié la perturbation des biofilms A. baumanni AB183 matures en faisant varier les concentrations de lysAB-vT2-fusion. Des biofilms d'A. baumanni AB183 ont été formés sur des plaques MBEC à 96 puits pendant 3 jours et la destruction médiée par l'endolysine des bactéries du biofilm a été quantifiée par un traitement ultérieur de 24 h utilisant des dilutions d'endolysine ne mesurant que les cellules du biofilm. (B) Effet adjuvant de la fusion lysAB-vT2 (2 mg/ml) avec traitement simultané et échelonné (après 24 h) du bactériophage vPhT2 (Φ2) sur des biofilms matures d'A. baumanni AB183 * Les astérisques indiquent P ≤ 0,05 *** Les astérisques indiquent P ≤ 0,001.

Pour évaluer l'effet adjuvant de l'endolysine de fusion lysAB-vT2 avec le phage vPhT2 dans la clairance des biofilms d'A. baumanni, le traitement a été effectué par une exposition simultanée et séquentielle. Nos données montrent qu'un traitement séquentiel d'endolysine pendant 24 h, puis de phage vPhT2 pendant 24 h supplémentaires n'a pas diminué de manière significative le nombre d'UFC dans le biofilm (Fig. 7B). Cependant, le traitement simultané de biofilms matures d'Acinetobacter par la fusion lysAB-vT2 (2 mg/ml) et le phage vPhT2 (1 × 108 PFU/ml) en même temps donne des UFC significativement plus faibles restant dans les biofilms (p < 0,05), suggérant une le traitement de l'endolysine et du phage est meilleur qu'échelonné.

Pour les tests de cytotoxicité, l'activité LDH basale semblait être relativement élevée à environ 40 %. La fusion LysAB-vT2 seule semblait entraîner une augmentation d'environ 10 % de la libération de LDH par les cellules humaines T24 par rapport à la condition basale. Cela a été renvoyé comme une différence statistiquement significative par rapport au groupe non traité (* ; p < 0,05). La co-incubation de la fusion lysAB-vT2 avec des cellules humaines T24 infectées par AB183 a entraîné une réduction partielle de la libération de LDH par les T24 (diminution d'environ 15 % par rapport aux cellules avec AB183 et véhicule vide ajouté), ce qui indique que l'endolysine était capable de inactivant AB183 à une concentration de 2 mg/ml, cependant les niveaux relatifs de cytotoxicité sont restés élevés (~ 75 %) (Fig. 8A).

Cytotoxicité de l'endolysine (fusion-LysVTh2) pour les cellules épithéliales humaines. AB183 a été cultivé pendant une nuit dans du milieu de Leibovitz et utilisé pour infecter des cellules pendant 1 h avant d'ajouter 2 mg/ml de fusion lysAB-vT2 aux échantillons pertinents et d'incuber pendant 23 h supplémentaires. Le test de cytotoxicité LDH a ensuite été réalisé à l'aide du kit Invitrogen CyQUANT. (A) Récupération et cytotoxicité du traitement par fusion lysAB-vT2 de cellules épithéliales humaines T24 infectées par A. baumanni AB183. (B) Cytotoxicité après récupération des cellules épithéliales humaines T24 de l'infection AB183 après traitement simultané par endolysine de fusion lysAB-vT2 et antimicrobiens ; CuCl2 (1,62 mM) et sulfate de colistine (0,5 µg/ml).

Évaluer le potentiel d'utilisation des endolysines avec d'autres antimicrobiens, la cytotoxicité du co-traitement des cellules épithéliales humaines infectées et non infectées avec la fusion lysAB-vT2 et les antimicrobiens : chlorure de cuivre (CuCl2) et sulfate de colistine. Le traitement des cellules épithéliales humaines T24 infectées et non infectées par AB183 par lysAB-vT2 (2 mg/ml) et du chlorure de cuivre (1,62 mM) n'a entraîné aucune différence significative dans la libération de LDH par rapport au témoin non traité/non infecté. La même chose a été constatée avec l'exposition des cellules T24 à la fusion lysAB-vT2 (2 mg/ml) et au sulfate de colistine (0,5 µg/ml), sans différence de cytotoxicité vis-à-vis des cellules T24 par rapport aux témoins à libération spontanée. L'infection AB183 des cellules T24 a également été traitée avec succès dans toutes les combinaisons de traitement antimicrobien (Fig. 8B).

Des enzymes dérivées de bactériophages telles que les endolysines ont été étudiées pour lutter contre l'émergence de bactéries multirésistantes. Dans cette étude, nous avons étudié la protéine endolysine de vPhT2.

La diversité des endolysines dépend du domaine catalytique enzymatique (ECD) responsable du clivage d'une liaison peptidoglycane spécifique et des domaines de liaison cellulaire (CBD), qui sont responsables de la reconnaissance d'épitopes spécifiques sur la paroi cellulaire bactérienne18. Les endolysines avec un domaine de liaison à la paroi cellulaire (CBD) n'ont été identifiées que dans certains bactériophages A. baumannii qui étaient des endolysines ElyA1 et ElyA2 contenant un domaine de liaison au peptidoglycane PG3 à l'extrémité N-terminale (11). L'analyse BLAST de lysAB-vT2 a prédit un ECD et un domaine conservé par le lysozyme, mais un CBD était absent dans cette endolysine (Fig. 1A). Les ECD des endolysines lysAB-vT2 étaient une muramidase (N-acétyl-β-D-muramidase) qui clive les liaisons β-1,4-glycosidiques entre l'acide N-acétylmuramique et une N-acétylglucosamine, ce qui était en accord avec les rapports précédents7, 8. Des études de relation phylogénétique entre lysAB-vT2 et d'autres lysines d'A. baumannii ont montré qu'il était étroitement lié à une endolysine provenant du phage non classé RL_2015 et du phage AM24 isolé en 2014 (Moscou, Russie)19.

Deux endolysines recombinantes ont été exprimées et purifiées. En accord avec un rapport précédent, nous avons constaté que les deux endolysines présentaient le spectre de la carte pour lyser les cellules autoclavées de bactéries Gram-négatives8. La CMI du lysAB-vT2 natif était supérieure à 10 mg/ml. En raison du manque de CBD de lysAB-vT2 natif, l'endolysine native ne peut pas traverser et atteindre la couche interne de peptidoglycanes dans l'espace périplasmique des bactéries Gram-négatives17. De plus, nous avons trouvé un médiateur de lyse holin (GenBank : QHJ75701.1) dans le génome de vPhT2. Les holines sont des protéines membranaires codées par les phages qui contrôlent l'accès des endolysines codées par les phages au peptidoglycane et déclenchent ainsi le processus de lyse. Les propriétés physicochimiques des lysines Gram-négatives, telles que la charge nette, l'hydrophobicité, le moment hydrophobe et l'indice aliphatique sont responsables d'une meilleure interaction avec l'enveloppe Gram-négative20. Ainsi, nous avons généré une fusion d'acides aminés hydrophobes avec l'endolysine de lysAB-vT2, puisque les polypeptides hydrophobes avaient permis la pénétration de la membrane externe21. Par rapport au lysAB-vT2 natif, la CMI de la fusion lysAB-vT2 a été réduite à 5 fois et nous nous sommes concentrés sur l'activité de la fusion lysAB-vT2. La partie lipidique à l'extrémité C-terminale de la fusion lysAB-vT2 a aidé à ancrer l'antibiotique à la membrane bactérienne à travers sa partie lipidique, comme le rapportent Anikin et al.22.

Les combinaisons de colistine et d'endolysine contre des souches cliniques de bactéries multirésistantes, telles que A. baumannii et P. aeruginosa ont été rapportées in vitro et in vivo 8,11. Notre étude a révélé que les interactions entre la fusion lysAB-vT2 avaient une activité antibactérienne élevée avec la colistine, la polymyxine B et le CuCl2. La colistine et la polymyxine B sont des antibiotiques chargés positivement qui se lient à travers les groupes phosphate chargés négativement du lipide A et sa chaîne grasse acyle terminale hydrophobe, provoquant une expansion de la membrane externe externe (MO)23. Une perméabilisation de l'OM se produit, permettant à l'endolysine de traverser l'OM et de cliver l'hydrolyse de la couche de peptidoglycane. Il n'y avait aucune différence dans la combinaison de lysAB-vT2-fusion avec l'imipénem au niveau de 0,25 × CMI des deux agents. L'imipénème, un antibiotique bêta-lactamine de la classe des carbapénèmes, agit en inactivant les protéines de liaison à la pénicilline (PBP). Au niveau sous-MIC, les deux agents sont limités dans leur accès au peptidoglycane en raison de la présence de la membrane externe bactérienne comme barrière structurelle. De plus, les ions cuivre (Cu+) ont été utilisés comme agents antimicrobiens dans l'agriculture et les soins de santé. Aux niveaux sous-MIC, les cellules exposées aux surfaces de cuivre peuvent induire des dommages à la membrane24 et permettre à l'endolysine de traverser l'OM pour renforcer l'activité antibactérienne de l'enzyme. La fusion lysAB-vT2 plus colistine peut inhiber la croissance de diverses souches d'A. baumannii, telles que XDRAB, MDRAB, mais pas l'A. baumannii résistant à la colistine (COLRAB). Ce phénomène peut s'expliquer par le fait que la CMI du COLRAB dans cette étude était de 32 μg/ml et qu'une faible concentration de colistine (0,5 μg/ml) a été utilisée, en association avec l'enzyme et que cette concentration peut ne pas être suffisante pour détruire la voie externe. membrane externe (MO) des souches résistantes à la colistine et ne permet pas à l'enzyme de fonctionner.

Afin d'appliquer la fusion lysAB-vT2 en tant que produit antibactérien dans l'environnement clinique, la stabilité thermique, les analyses de biofilm et la cytotoxicité de la fusion lysAB-vT2 ont été déterminées. Des tests de stabilité thermique ont montré que l'endolysine fonctionne toujours dans une large gamme de températures allant de 4 à 60 °C. Cependant, à 80 ° C, le pourcentage d'inhibition de la fusion lysAB-vT2 a chuté en raison de la dénaturation des protéines. En accord avec les rapports précédents, la fusion lysAB-vT2 peut inhiber la formation de biofilms et diminuer les biofilms matures10,25,26. Notre étude a révélé que 4 mg/ml d'endolysine et de phage vPhT2 peuvent inhiber les biofilms matures. La concentration en MBEC était supérieure au niveau de la CMI. Ce phénomène peut s'expliquer par la structure des biofilms qui sont enveloppés par une matrice de substance polymère extracellulaire (EPS)26 et contribuent à une MBEC élevée. Il a été constaté que la fusion lysAB-vT2 peut être utilisée efficacement en conjonction avec la phagothérapie pour perturber les biofilms d'A. baumanni. Contrairement aux découvertes dans la littérature qui trouvent que la thérapie antimicrobienne-phagique échelonnée est plus efficace, le traitement simultané utilisant à la fois le phage et l'endolysine de fusion lysAB-vT2 s'est avéré plus efficace que le traitement séquentiel pour perturber les biofilms27. Cette occurrence peut s'expliquer par le fait que, contrairement aux antimicrobiens plus traditionnels, les endolysines phages n'interfèrent pas avec le cycle de vie des phages dans les biofilms.

Contrairement aux rapports précédents, les phages et les enzymes phagiques d'A. baumannii se sont révélés sûrs et ne présentaient aucune cytotoxicité pour les lignées cellulaires humaines12,16, même lorsqu'ils étaient utilisés en association avec d'autres antimicrobiens. Notre étude a révélé que l'endolysine est capable d'inactiver A. baumannii pour provoquer une toxicité cellulaire, mais les niveaux relatifs de cytotoxicité restent élevés. Cela est dû au fait qu'une concentration élevée de l'enzyme a été utilisée par rapport à l'étude précédente.

En conclusion, nous avons cloné et exprimé l'endolysine de fusion d'acides aminés hydrophobes de phage, fusion lysAB-vT2. Cette enzyme a une activité antibactérienne, a la capacité de diminuer le biofilm mature et a un effet synergique avec la colistine. Associée à la colistine ou seule, cette enzyme peut inhiber diverses souches d'A. baumannii, dont MDRAB, XDRAB et A. baumannii résistant aux phages.

Le bactériophage vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) a été isolé et caractérisé comme décrit précédemment10. Pour tester l'activité antibactérienne, nous avons utilisé des isolats d'A. baumannii collectés de 2006 à 2021 dans cinq hôpitaux en Thaïlande et A. baumannii isolé en 2021 dans l'environnement hospitalier de l'hôpital universitaire de Naresuan (tableau S1). Les souches d'A. baumannii étaient des A. baumannii sensibles aux médicaments (NR), des A. baumannii multirésistants (MDRAB), des A. baumannii extrêmement résistants aux médicaments (XDRAB), des A. baumannii résistants aux carbapénèmes (CRAB), des A. résistants à la colistine A. baumannii (COLRAB) et des souches d'A. baumannii résistantes aux phages (PRAB) d'une étude précédente28. La sensibilité aux antibiotiques de tous les isolats a été déterminée selon le CLSI 201729 et est présentée dans le tableau S1. Les souches d'A. baumannii ont été cultivées dans du bouillon Luria-Bertani (LB) ou de la gélose. Des E. coli recombinants BL21 (DE3) contenant les constructions pET28a-lysAB-vT2 et pET28a-lysAB-vT2-fusion ont été cultivés dans du bouillon Luria-Bertani (LB) et de l'agar, additionnés de 50 µg/ml de kanamycine et 10 ug/ml de chloramphénicol. Le protocole a été approuvé par le comité de biosécurité institutionnel de l'Université de Naresuan et le numéro de projet était NUIBC MI 64-08-32.

Le gène d'endolysine de vPhT2 (numéro d'accès MN864865) flanqué des sites de restriction BamHI et EcoRI dans pET28a a été généré en utilisant un système de synthèse de gène (script de gène). De plus, la fusion hydrophobe d'endolysine a été générée dans pET28a, en ajoutant un gène codant pour des acides aminés hydrophobes (FILIVFVLIIAP) en C-terminal. Les vecteurs pET28a qui contenaient le gène de l'endolysine (lysAB-vT2) et la fusion hydrophobe de l'endolysine (lysAB-vT2-fusion), ont été transformés dans E. coli DH5α et les plasmides ont été purifiés et sous-clonés dans E. coli BL21 (DE3) pLysS. La digestion de restriction a été utilisée pour vérifier l'intégrité du fragment cloné. Pour la surexpression des enzymes de phages recombinants, une culture en phase logarithmique de E. coli BL21 (DE3) pLysS contenant pET28a avec lysAB- vT2 ou lysAB- vT2-fusion (A600–0,5) a été induite par l'ajout d'IPTG à la concentration finale de 1 mM. Après incubation pendant 4 h à 37 °C, les cellules ont été culottées, lavées et congelées à - 80 °C. Les cellules congelées ont été remises en suspension dans 10 ml de tampon de lyse (NaCl 145 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4). Les échantillons ont été congelés-décongelés 3 à 4 fois, puis 100 µl de Triton X-100 (concentration finale 1 % v/v) ont été ajoutés et soniqués sur de la glace jusqu'à ce qu'un lysat clair soit observé. Après cela, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 tr/min à 4 °C pendant 10 min. Les surnageants (fraction soluble) ont été collectés pour purifier les protéines recombinantes en utilisant une colonne de chromatographie d'affinité His-tag (His·Bind Kits, Novagen, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. Les fractions protéiques purifiées ont été regroupées et dialysées contre du tampon de dialyse pendant une nuit. La pureté de la protéine a été contrôlée par SDS-PAGE à 12 %, suivi d'une coloration des gels SDS-PAGE avec du bleu brillant de Coomassie G-250.

Les tests de lyse sur plaque ont été effectués comme décrit précédemment7 en utilisant des cellules bactériennes de A. baumannii ATCC 19606, A. baumannii AB003 (MDRAB), A. baumannii AB329 (XDRAB), Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 ou Staphylococcus aureus ATCC 6538. Les bactéries ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique moyenne, collectées, lavées une fois et mises en suspension dans du PBS. La suspension a ensuite été autoclavée et centrifugée. Le culot résultant a été remis en suspension dans du PBS (2 % [vol/vol] du volume de culture initial) et a été utilisé comme substrat. 5 µl d'enzymes purifiées (4 mg/ml) ont été déposés sur la plaque de gélose (1,5 %) contenant le substrat (5 %). Un volume égal de 20 ug de lysozyme de blanc d'œuf (EWL) a été utilisé comme témoin. Les plaques tachées ont été incubées à température ambiante. Des zones claires ont été observées et le diamètre des zones claires a été mesuré.

La CMI de lysAB-vT2 ou lysAB-vT2-fusion contre A. baumannii ATCC 19606 et A. baumannii isolats cliniques a été déterminée selon la méthode standard de microdilution en bouillon du Clinical and Laboratory Standards Institute24. En bref, des dilutions en série de deux fois de chaque enzyme ont été préparées dans du bouillon Mueller Hinton (MHB) dans une plaque de microtitration stérile à fond en U à 96 puits. L'inoculum a été préparé en cultivant A. baumannii sur LBA et a été maintenu à 37 ° C pendant la nuit. Les colonies d'A. baumannii ont été remises en suspension dans une solution de NaCl à 0,85 % à une concentration d'inoculum de 0,5 McFarland à l'aide d'un densitomètre pour obtenir une concentration de 1 × 105 UFC/ml. Chaque puits a été inoculé avec 50 µl de solution bactérienne, de sorte que la concentration finale de l'inoculum était de 0,5 × 105 UFC/puits. La plaque a été incubée à 37°C pendant une nuit. La CMI a été définie comme la plus faible concentration d'enzymes qui inhibe la croissance visible.

Les interactions entre lysAB-vT2 ou lysAB-vT2-fusion avec trois antibiotiques (imipénème, colistine et polymyxine B), trois désinfectants (composé d'ammonium quaternaire (CAQ), chloroxylénol, hypochlorite de sodium), deux métaux lourds (CuCl2, ZnCl2) et un bactériophage Les vPhT2 ont été criblés par un test d'inhibition de la croissance à 0,25 × la CMI de deux agents. L'hôte pour tester tous les agents était ATCC 19606. A. baumannii AB329 a été utilisé pour tester le bactériophage. Le pourcentage d'inhibition a été calculé selon la formule ci-dessous

La méthode de microdilution du bouillon en damier a été utilisée pour déterminer l'interaction entre la fusion lysAB-vT2 et les antibiotiques sélectionnés30. Les résultats des tests de deux agents agissant individuellement ou en combinaison ont été utilisés pour calculer l'indice FIC (FICI) qui était la somme des concentrations inhibitrices fractionnaires (FIC) de deux agents selon la formule : indice FIC = FIC de lysAB-vT2-fusion + FIC d'antibiotique, où FIC fusion lysAB-vT2 est la CMI de fusion lysAB-vT2 dans la combinaison/CMI de fusion lysAB-vT2 seul et FIC antibiotique est la CMI d'antibiotique dans la combinaison/CMI d'antibiotiques seuls.

L'indice FIC des agents améliorés a été interprété comme suit : FIC ≤ 0,5, synergique ; FICI = 0,5–4, additif ou indifférence ; et FICI > 4, antagoniste25.

Activité antibactérienne de la fusion lysAB-vT2 contre E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, K. pneumoniae ATCC 27736 et diverses souches d'A. baumannii, qui étaient des souches sensibles aux médicaments (NR), A. baumannii multirésistant (MDRAB), A. baumannii extrêmement résistant aux médicaments (XDRAB), A. baumannii résistant aux carbapénèmes (CRAB) et A. baumannii résistant à la colistine (COLRAB) a été testé. En bref, A. baumannii a été cultivé dans de la gélose LB incubée pendant une nuit à 37 ° C. Ensuite, les cultures ont été diluées dans du bouillon LB, la turbidité des suspensions cellulaires a été ajustée à une norme McFarland équivalente de 0,5 telle que mesurée par un densitomètre correspondant à environ 1 × 108 UFC/ml. Les suspensions cellulaires ajustées ont été diluées à 1:100 dans du bouillon Mueller Hilton à double renforcement et 50 µl ont été inoculés dans des plaques de microtitration à 96 puits, puits U inférieurs (Nunc, États-Unis). 50 µl des enzymes à la concentration MIC (2 mg/ml) ou des enzymes (10 µg/ml) avec de la colistine (0,5 µg/ml) à des concentrations sous-MIC ont été ajoutés à chaque puits. Après une nuit d'incubation à 37 °C, 50 ul de TTC stérilisé sur filtre à 0,1 % (Hi-media) ont été ajoutés. La plaque a été incubée à température ambiante dans l'obscurité pendant 3 h. L'absorbance à OD540 a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Synergy 2 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). L'expérience a été répétée deux fois avec des échantillons en triple. Le pourcentage d'inhibition contre tous les A. baumannii a été calculé comme décrit précédemment7.

Pour déterminer la stabilité de l'activité antibactérienne dans diverses conditions de température, 2 mg/ml de fusion lysAB-vT2 ont été incubés à 4, 20, 40, 60 et 80 °C, chacun pendant 30 min. Après incubation, l'activité antibactérienne a été déterminée en utilisant un test d'inhibition bactérienne. La concentration en protéines a été mesurée après le traitement thermique et le pourcentage de réduction des protéines a été calculé.

Pour le dosage du biofilm, l'endolysine et le phage vPhT2 ont été appliqués à la souche productrice de biofilm A. baumannii AB183 de 72 h et la capacité de l'endolysine purifiée à éliminer les biofilms de 72 h a été évaluée via le test de concentration minimale d'éradication du biofilm (dosage MBEC). Les biofilms ont été cultivés pendant 72 h dans du bouillon LB à 37 ° C, ont été exposés à diverses concentrations d'endolysine purifiée et à 1 × 108 PFU / ml de phage vPhT2 dans du bouillon Mueller Hinton pendant 24 h. Des essais adjuvants d'endolysine-phage ont été effectués avec un traitement simultané et séquentiel de biofilms AB183 matures de 72 h avec du phage et de l'endolysine, avec un traitement séquentiel traitant d'abord les biofilms pendant 24 h avec le phage vPhT2, puis un traitement ultérieur de 24 h avec l'endolysine de fusion lysAB-vT2. Après le traitement, les biofilms ont été soniqués dans du PBS et le nombre de bactéries survivantes dans le biofilm a été quantifié en placant le PBS résultant contenant le biofilm soniqué pour déterminer les UFC. Pour le test de cytotoxicité, des cellules épithéliales de vessie humaine T24 (ATCC® HTB-4™) et A. baumannii AB183 ont été utilisées et préparées comme décrit précédemment (Styles 2020). Test de cytotoxicité LDH réalisé à l'aide du kit Invitrogen CyQUANT selon le protocole du fabricant.

Tous les tests ont été réalisés indépendamment en trois exemplaires et les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type. L'analyse des données a été effectuée à l'aide d'une ANOVA à un facteur pour les comparaisons de groupe avec le contrôle et le test T non apparié pour les comparaisons par paires (Fig. 7A). p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Les ensembles de données pour cette recherche sont inclus dans les tableaux supplémentaires.

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Ce travail a été soutenu par la subvention du Newton Fund - NRCT Thailand Research and Innovation Partnership Fund, British Council Newton Fund Institutional Links Award, Application ID: 623760210 to SS and APS et par le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) et l'Université de Warwick a financé le Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) [numéro de subvention BB/M01116X/1] à GKD, NB et APS.UL a été soutenu par le Royal Golden Jubilee Ph.D. Programme (PHD/0227/2560). GKD et NB détiennent une bourse de doctorat financée par le Midlands Integrative Biosciences Training Partnership. PT a été financé par la subvention Institutional Links Grant (623760210), dans le cadre du UK-Thailand Research and Innovation Partnership Fund.

Département de microbiologie et de parasitologie, Faculté des sciences médicales, Université de Naresuan, Muang, Phitsanulok, 65000, Thaïlande

Sutthirat Sitthisak, Suphattra Manrueang, Supat Khongfak, Udomluk Leungtongkam, Rapee Thummeepak et Aunchalee Thanwisai

Centre d'excellence en biotechnologie médicale, Faculté des sciences médicales, Université Naresuan, Phitsanulok, 65000, Thaïlande

Sutthirat Sitthisak

École des sciences de la vie, Université de Warwick, Coventry, CV4 7AL, Royaume-Uni

Nathan Burton, Gurneet K. Dhanoa, Timothy Tsapras et Antonia P. Sagona

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SS et APS : Conceptualisation et supervision de l'étude ; SS, APS, RT, AT : conçu et conçu les expériences ; SS : interprétation des données ; SM, SK, UL, NB, GKD, PT : ont réalisé les données et l'analyse bioinformatique ; UL, SM, SK, NB, GKD, PT : ont réalisé des expériences et préparé les figures, SS : ont rédigé la première ébauche du manuscrit ; APS : édition du manuscrit ; SS et APS : acquisition de financement. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Sutthirat Sitthisak ou Antonia P. Sagona.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Sitthisak, S., Manrueang, S., Khongfak, S. et al. Activité antibactérienne de l'endolysine de fusion d'acides aminés hydrophobes du phage vB_AbaM_PhT2, associée à la colistine contre Acinetobacter baumannii. Sci Rep 13, 7470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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Reçu : 31 août 2022

Accepté : 19 avril 2023

Publié: 08 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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